1、目的:
高遷移率族蛋白B1(HighMobilityGroupBoxProtein1,HMGB1)是生物有機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子,在細(xì)胞核內(nèi)和核外發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,HMGB1與肝臟炎癥損傷也密切相關(guān)。雖然肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞不主動(dòng)釋放HMGB1,但氧化應(yīng)激是否能夠誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放HMGB1并不清楚。本研究目的在于了解氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞釋放HMGB1的關(guān)系。
方法:
以體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)
2、對(duì)象,用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型,觀察HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激各項(xiàng)指標(biāo):丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)活性、以及谷胱甘肽過氧化物酶(GlutathionePeroxidase,GSH-Px)活性,確定氧化應(yīng)激模型成功建立。用N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)和雷帕霉素(Rapamycin,RPM)分別處理H2
3、O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,觀察細(xì)胞HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放:ELISA(Enzyme-LinkedImmunoadsorbentAssay)方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1的釋放,免疫細(xì)胞化學(xué)方法和熒光染色方法觀察HMGB1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布,RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)方法檢測(cè)HMGB1mRNA的表達(dá),分析氧化應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞HM
4、GB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的影響,探索NAC和RPM對(duì)氧化應(yīng)激模型HepG2細(xì)胞HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的作用。
結(jié)果:
用100μmol/L的H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞能夠成功建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,在H2O2誘導(dǎo)16h后,應(yīng)激組細(xì)胞存活率與對(duì)照組差異沒有顯著性,但氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量、SOD和GSH-Px活性變化顯著。用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立的氧化應(yīng)激模型中,HMGB1表達(dá)增加,并有HMGB1轉(zhuǎn)位至
5、細(xì)胞質(zhì),而且釋放至胞外上清液中的的HMGB1量顯著增多;用NAC作用于HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型能夠顯著減少其HMGB1的表達(dá)和釋放,而雷帕霉素作用于HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型可抑制HMGB1的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位,但不影響氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞表達(dá)HMGB1。
結(jié)論:
一、為進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激與HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型:在H2O2濃度100
6、μmol/L作用16h后,肝細(xì)胞存活率沒有顯著降低,而MDA含量、SOD和GSH-Px活性發(fā)生了顯著變化。HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
二、HepG2細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)16h后,細(xì)胞表達(dá)HMGB1顯著增強(qiáng),并且出現(xiàn)HMGB1細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1釋放顯著上升。HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激與HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放存在聯(lián)系。
三、N-乙酰半胱氨酸能夠有效抑制H2O2誘