三氧化二砷誘導RA滑膜細胞凋亡機制的體外研究.pdf

1、目的：在人類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細胞(FLS)體外原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，分析和探討三氧化二砷對FLS誘導凋亡中可能發(fā)生的機制-通過激活線粒體途徑，釋放細胞色素C，進而活化Caspases，啟動細胞內(nèi)凋亡，并能夠影響B(tài)cl-2 mRNA的表達調(diào)節(jié)該途徑，從而探討三氧化二砷在治療類風濕關(guān)節(jié)炎中的價值。 方法：本試驗雙酶消化法體外培養(yǎng)RA患者關(guān)節(jié)滑膜細胞，在光鏡、電鏡、HE染色、細胞免疫組化等方法鑒定為人成纖維樣滑膜細胞(HFL

2、S)，電鏡、DNA凝膠電泳、流式細胞術(shù)、Caspase-3活性檢測等多種手段證實一定濃度范圍的三氧化二砷可以誘導HFLS凋亡的基礎(chǔ)上，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)定量檢測不同濃度三氧化二砷對5例RA HFLS分別作用6、24和48小時后釋放到細胞漿內(nèi)的細胞色素C(CytC)含量；RT-PCR半定量檢測一定濃度下的三氧化二砷作用HFLS48小時后細胞Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達，探討三氧化二砷誘導凋亡作用中線粒體改變帶來

3、的變化以及Bcl-2是否參與了對線粒體的調(diào)控；并用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析。 結(jié)果： 1．在細胞凋亡早期，胞漿中的細胞色素C的含量即發(fā)生變化。ELISA檢測不同濃度的三氧化二砷作用6小時后，胞漿內(nèi)的CytC較空白對照組顯著升高，有統(tǒng)計學意義。藥物作用24小時后CytC含量顯著增高，并且在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)其作用呈一定劑量依賴性。48小時后CytC含量在20μmol/L時較24小時增加不明顯．在

4、藥物濃度為80μmol/L時，CytC含量變化與40μmol/L比較無統(tǒng)計學意義，推測在三氧化二砷劑量大的情況下可能導致細胞壞死，細胞膜崩解，而不是首先出現(xiàn)線粒體的改變。 2．RT-PCR檢測不同濃度的三氧化二砷作用HFLS 48小時后細胞中Caspase-3的mRNA表達顯著增強，并且在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)其作用呈一定劑量依賴性。證實了線粒體中CytC等促凋亡因子的釋放后激活了細胞凋亡的內(nèi)部途徑，這可能是三氧化二砷誘

5、導HFLS凋亡的機制之一。 3．RT-PCR．檢測發(fā)現(xiàn)在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)的AS<,2>O<,3>作用48小時后HFLS的Bcl-2基因表達較空白對照組減弱，與劑量呈負相關(guān)。Bcl-2基因表達參與了調(diào)控三氧化二砷對HFLS誘導凋亡過程。 結(jié)論： 2-40μmol/L 濃度范圍內(nèi)的三氧化二砷作用HFLS均發(fā)生凋亡，與其劑量呈一定的相關(guān)性，而且提示三氧化二砷的凋亡誘導作用一通過激活線粒體，使CytC、AI