三氧化二砷誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制的體外研究.pdf

1、目的：在人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)體外原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，分析和探討三氧化二砷對(duì)FLS誘導(dǎo)凋亡中可能發(fā)生的機(jī)制-通過激活線粒體途徑，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而活化Caspases，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡，并能夠影響B(tài)cl-2 mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)該途徑，從而探討三氧化二砷在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的價(jià)值。 方法：本試驗(yàn)雙酶消化法體外培養(yǎng)RA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，在光鏡、電鏡、HE染色、細(xì)胞免疫組化等方法鑒定為人成纖維樣滑膜細(xì)胞(HFL

2、S)，電鏡、DNA凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3活性檢測(cè)等多種手段證實(shí)一定濃度范圍的三氧化二砷可以誘導(dǎo)HFLS凋亡的基礎(chǔ)上，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)定量檢測(cè)不同濃度三氧化二砷對(duì)5例RA HFLS分別作用6、24和48小時(shí)后釋放到細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素C(CytC)含量；RT-PCR半定量檢測(cè)一定濃度下的三氧化二砷作用HFLS48小時(shí)后細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2 mRNA表達(dá)，探討三氧化二砷誘導(dǎo)凋亡作用中線粒體改變帶來

3、的變化以及Bcl-2是否參與了對(duì)線粒體的調(diào)控；并用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1．在細(xì)胞凋亡早期，胞漿中的細(xì)胞色素C的含量即發(fā)生變化。ELISA檢測(cè)不同濃度的三氧化二砷作用6小時(shí)后，胞漿內(nèi)的CytC較空白對(duì)照組顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物作用24小時(shí)后CytC含量顯著增高，并且在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)其作用呈一定劑量依賴性。48小時(shí)后CytC含量在20μmol/L時(shí)較24小時(shí)增加不明顯．在

4、藥物濃度為80μmol/L時(shí)，CytC含量變化與40μmol/L比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)在三氧化二砷劑量大的情況下可能導(dǎo)致細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜崩解，而不是首先出現(xiàn)線粒體的改變。 2．RT-PCR檢測(cè)不同濃度的三氧化二砷作用HFLS 48小時(shí)后細(xì)胞中Caspase-3的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，并且在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)其作用呈一定劑量依賴性。證實(shí)了線粒體中CytC等促凋亡因子的釋放后激活了細(xì)胞凋亡的內(nèi)部途徑，這可能是三氧化二砷誘

5、導(dǎo)HFLS凋亡的機(jī)制之一。 3．RT-PCR．檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在2-40μmol/L濃度范圍內(nèi)的AS<,2>O<,3>作用48小時(shí)后HFLS的Bcl-2基因表達(dá)較空白對(duì)照組減弱，與劑量呈負(fù)相關(guān)。Bcl-2基因表達(dá)參與了調(diào)控三氧化二砷對(duì)HFLS誘導(dǎo)凋亡過程。 結(jié)論： 2-40μmol/L 濃度范圍內(nèi)的三氧化二砷作用HFLS均發(fā)生凋亡，與其劑量呈一定的相關(guān)性，而且提示三氧化二砷的凋亡誘導(dǎo)作用一通過激活線粒體，使CytC、AI