JWA在三氧化二砷誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、三氧化二砷(As2O3)已經(jīng)成為治療新確診的和復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的經(jīng)典藥物，其治療APL的主要機(jī)制是誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。As2O3的促凋亡作用不僅局限于APL細(xì)胞，對(duì)一些其他類型白血病及包括肝癌、前列腺癌、腎癌、食管癌、宮頸癌和膀胱癌在內(nèi)的實(shí)體瘤細(xì)胞均有促凋亡作用。As2O3的作用機(jī)制復(fù)雜，在白血病細(xì)胞中主要通過(guò)作用于PML-RARα和PML蛋白而誘導(dǎo)分化和凋亡，但是As2O3誘導(dǎo)實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不完全清楚。

2、As2O3可通過(guò)產(chǎn)生活性氧(RDS)，活化MAPK家族蛋白分子，抑制Bcl-2家族成員蛋白表達(dá)，損傷線粒體膜電位，釋放線粒體色素C，激活caspases(caspase-3，-8和-9)等信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。As2O3作用的信號(hào)通路多且復(fù)雜，并且由于特定細(xì)胞的組織起源和特異性不同而不同。As2O3的生物學(xué)作用受劑量或濃度、作用時(shí)間等因素影響。 JWA基因(AF070523.1)是周建偉等1998年發(fā)現(xiàn)，從培養(yǎng)的原代人氣管和

3、支氣管上皮細(xì)胞中分離并克隆的受維甲酸誘導(dǎo)的新的細(xì)胞骨架樣基因。通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，JWA基因啟動(dòng)子序列中含有多種反應(yīng)元件，如TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbo1-13 acetate)反應(yīng)元件(TRE)、hemin反應(yīng)元件(HRE)、熱休克反應(yīng)元件(hRE)、應(yīng)激反應(yīng)元件(SRE)和ATRA反應(yīng)元件(ARE)半位點(diǎn)等。在JWA編碼蛋白中有兩個(gè)含絲氨酸殘基的PKC(protein kinase C)磷酸化位點(diǎn)(S

4、DR-SLR)。本課題組多年來(lái)一直圍繞JWA基因的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系開(kāi)展研究工作，取得了一系列原創(chuàng)性有意義的研究成果。先后證實(shí)JWA是一種新的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associatedprotein，MAP)，不僅廣泛地參與調(diào)節(jié)多種分化和/或凋亡誘導(dǎo)劑(如TPA，ATRA，4HPR和As2O3)涉及的信號(hào)通路，而且活躍地參與細(xì)胞對(duì)應(yīng)激刺激(如氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激)的應(yīng)答，但是JWA參與細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不明確。

5、 本研究主要應(yīng)用As2O3為凋亡誘導(dǎo)劑，采用多種分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以實(shí)體瘤細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞Hela，乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型，探討JWA參與As2O3所誘導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞的凋亡及可能機(jī)制。一方面，通過(guò)對(duì)As2O3誘導(dǎo)實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制作進(jìn)一步探討，為基因干涉JWA和As2O3聯(lián)合運(yùn)用提高As2O3對(duì)實(shí)體瘤的療效提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而對(duì)治療和預(yù)防腫瘤提供新的科學(xué)依據(jù)；另一方面，初步闡明JWA參與凋亡的信號(hào)通路和分子機(jī)制，為最終闡明

6、JWA基因的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系提供證據(jù)。 一.JWA活躍地應(yīng)答AS2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡用Hoechst 33258染色、TUNEL流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V-PE流式細(xì)胞術(shù)三種方法測(cè)As2O3誘導(dǎo)HeLa, MCF-7細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率與As2O3的處理濃度呈劑量反應(yīng)關(guān)系，但HeLa細(xì)胞對(duì)As2O3誘導(dǎo)凋亡更為敏感：5μMAs2O3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞48h，凋亡率約100％，而5μMAs2O3誘

7、導(dǎo)MCF-7細(xì)胞48h，凋亡率約為25％。同時(shí)用Western Blot檢測(cè)JWA蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)JWA蛋白表達(dá)與As2O3濃度間呈劑量依賴性關(guān)系。提示JWA可能參與As2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。 二、JWA是AS2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡的必需分子為了探討JWA是否為As2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡的必需分子，我們成功構(gòu)建了JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞株，采用Hoechst 33258染色，M

8、TT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)As2O3處理JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞株后的凋亡率、生長(zhǎng)抑制的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在As2O3處理的JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞，與對(duì)照相比，其凋亡和生長(zhǎng)抑制顯著減弱。采用回復(fù)模型，即將JWA高表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到JWA表達(dá)缺陷的細(xì)胞中，使得JWA的蛋白表達(dá)水平恢復(fù)正常后，As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的水平也升高至對(duì)照水平。提示JWA表達(dá)對(duì)于As2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡可能是必需的。 三、JWA通過(guò)線粒體通路調(diào)節(jié)As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

9、亡細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制主要涉及線粒體通路和與線粒體無(wú)關(guān)的死亡受體通路。為進(jìn)一步探討JWA調(diào)節(jié)As2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們首先需要甄別JWA的作用與哪條信號(hào)通路有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)As2O3處理JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中這兩條通路上特異性天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶caspase-8，caspase-9的差異，發(fā)現(xiàn)caspase-9在JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞中剪切顯著減少即凋亡顯著減弱，而caspase-8無(wú)顯著變化；在JWA回

10、復(fù)轉(zhuǎn)染模型中， As2O3誘導(dǎo)caspase-9剪切的水平又顯著增加，說(shuō)明JWA在As2O3誘導(dǎo)HeLa和MCF-7細(xì)胞凋亡中主要通過(guò)caspase-9通路(即線粒體通路)而非死亡受體通路起促凋亡作用的。繼而我們又檢測(cè)線粒體通路上與caspase-9活化密切相關(guān)的線粒體膜電位的變化，用羅丹明123標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)在As2O3處理JWAF表達(dá)缺陷細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞24h線粒體膜電位變化的差異，發(fā)現(xiàn)在JWA表達(dá)缺陷細(xì)胞，As2O3誘導(dǎo)的線粒

11、體膜電位損傷被明顯抑止，這從另一角度說(shuō)明JWA是通過(guò)線粒體通路影響As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。 四、As2O3通過(guò)誘導(dǎo)ROS活性氧產(chǎn)生誘導(dǎo)JWA表達(dá)ROS是引起線粒體膜損傷的重要原因之一，ROS也是As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要分子，我們推測(cè)JWA對(duì)As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響可能與ROS相關(guān)。用DCFH-DA染色5μM As2O3處理的HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)(1h)ROS顯著增加，5μM As2O3處理HeLa細(xì)胞24h誘導(dǎo)的

12、細(xì)胞凋亡率和JWA蛋白表達(dá)也顯著增加。然而，當(dāng)聯(lián)合使用過(guò)氧化氫酶(catalase)去除細(xì)胞內(nèi)H2O2后，As2O3誘導(dǎo)的ROS幾乎被完全抑制，說(shuō)明ROS主要是以H2O2的形式存在；用過(guò)氧化氫酶處理HeLa細(xì)胞24h后，As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被顯著抑制，同時(shí)JWA表達(dá)水平也顯著下降，甚至低于正常水平。這些結(jié)果說(shuō)明H2O2可能作為As2O3的氧化代謝產(chǎn)物在其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用；而JWA達(dá)可能由于As2O3誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2誘

13、導(dǎo)；ROS/JWA可能是與As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制密切相關(guān)的分子。 五、JWA對(duì)As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)分子的影響MAPK信號(hào)分子是細(xì)胞凋亡線粒體通路上的重要分子，Bcl-2家族蛋白成員也是依賴線粒體凋亡通路上的重要的調(diào)節(jié)分子。我們推測(cè)JWA的作用可能是通過(guò)對(duì)MAPK信號(hào)分子以及Bcl-2家族蛋白成員的影響而實(shí)現(xiàn)的。用As2O3(0，5μM)處理對(duì)NCl-HeLa和JWA達(dá)缺陷的HeLa細(xì)胞(asJWA-HeLa)24h，采

14、用Western Blot檢測(cè)MAPK信號(hào)分子和Bcl-2家族蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在asJWA-HeLa細(xì)胞，MEK，ERK1/2和JNK的磷酸化幾乎被完全抑制，而它們的本底水平(非磷酸化分子)沒(méi)有發(fā)生明顯變化；同時(shí)，As2O3誘導(dǎo)激活的磷酸化Bad水平在asJWA-HeLa細(xì)胞中進(jìn)一步增加，而B(niǎo)ad和Bcl-2本底水平也沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明JWA是通過(guò)對(duì)MAPK分子和Bcl-2家族成員的作用影響As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。

15、綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)： (1)在HeLa和MCF-7細(xì)胞中，As2O3可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2誘導(dǎo)JWA表達(dá)增加，從而引起一系列凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生； (2)JWA是As2O3誘導(dǎo)活化MEK-ERK，JNK通路且與線粒體膜電位，caspase-9活化密切相關(guān)的重要分子； (3)As2O3誘導(dǎo)的Bad的活化可能受JWA的調(diào)節(jié)，然而，其機(jī)制尚未清楚，JWA對(duì)Bad活化的作用可能通過(guò)MEK-ERK/JNK途徑，也可能是MEK-ERK/JNK以