超抗原SEA誘導T細胞增殖和無能的體內(nèi)外研究.pdf

1、超抗原是一類強大的免疫激活劑，它無需抗原提呈細胞的加工處理，而是以完整的蛋白質形式結合于MHC-Ⅱ類分子溝槽外側，激活大量的T 細胞，同時產(chǎn)生大量細胞因子。超抗原的這種高效免疫活性，使其成為一種新的腫瘤免疫治療模式。我們的實驗室多年來一直致力于腫瘤免疫治療的研究，通過克隆SEA 基因，對SEA 進行原核表達、分離純化，制備了活性較高的SEA蛋白；利用納米乳劑為載體包裹腫瘤特異性抗原MAGE-1-HSP70 融合蛋白與SEA 配比制備出一

2、種新型腫瘤納米疫苗，并研究了其理化和生物學特性以及抗腫瘤免疫效應；同時構建了肝癌靶向性SEA/CD80 基因共表達重組腺病毒載體，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其能有效地激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應。 但是在進一步的研究中人們發(fā)現(xiàn)，超抗原的多次刺激導致了T 細胞的免疫耐受，即一部分抗原特異性的T 細胞發(fā)生程序性死亡，余下的抗原反應性T 細胞對超抗原的再次刺激表現(xiàn)為無反應性，即無能。超抗原的這一特性給人們帶來了負面影響，限制了其在腫瘤治療中的應用，

3、因此超抗原的理論和作用機制的研究又成為熱點。但是要想將超抗原SEA 免疫治療應用于臨床，只研究理論機制是不夠的，超抗原本身的劑量、途徑和使用方法等對體內(nèi)外T 細胞免疫效應的正負影響及規(guī)律，對于SEA 的臨床實際應用同樣具有重要的指導意義，而這在國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)地研究報道，也是我們研究腫瘤超抗原疫苗的一個空缺。因此本研究的目的就是通過建立小鼠體內(nèi)和體外無能T細胞模型，從增殖反應、細胞膜表型變化和細胞因子的合成與釋放等方面系統(tǒng)全面地探討超抗

4、原SEA 影響T 細胞應答反應的量效關系及規(guī)律特點，為超抗原在腫瘤臨床免疫治療中的合理而有效地應用提供理論依據(jù)。 實驗內(nèi)容主要概括如下： 1. 超抗原SEA 對小鼠脾淋巴細胞活化和增值的體內(nèi)外影響 目的: 分別用SEA單次刺激體內(nèi)或體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞，觀察SEA 促進淋巴細胞活化和增殖的規(guī)律和特點。方法：①采用MTT法測定SEA刺激后脾淋巴細胞的增殖反應。②通過FACS 檢測SEA 初次刺激后脾淋巴細胞膜表

5、型的變化。③用CTLL-2 細胞測定細胞培養(yǎng)上清或血清中IL-2 的活性，并用FACS 檢測細胞內(nèi)IL-2 的水平。結果：在體外，使脾淋巴細胞顯著增殖的SEA 濃度范圍是1-1000ng/ml，選擇100ng/ml 作為觀察SEA 體外刺激能力的最佳劑量，其既能刺激T 細胞的顯著增殖，又不會導致過早的細胞死亡。在體內(nèi)，根據(jù)對T 細胞刺激程度和效力維持時間，選擇腹腔注射為最佳注射途徑；SEA 劑量在5-15μg 范圍內(nèi)均能促進CD3 表達

6、顯著上升，最佳劑量為10μg。體內(nèi)外結果均顯示，SEA 單次刺激促進了T 細胞活化的主要膜表面分子（CD69 和CD25）的表達顯著升高，使CD4 與CD8 的表達同步上升，IL-2 的合成和釋放快速增加。結論：在一定濃度范圍內(nèi)的SEA 對體內(nèi)外的T 細胞均具有強烈的活化和增殖作用，其對CD4 和CD8 亞群具有相同的增殖效果。為下一步研究超抗原誘導T 細胞無能的實驗提供依據(jù)和設計思路。 2. 超抗原SEA 誘導T 細胞無能的體

7、內(nèi)外研究 目的：建立T細胞無能的小鼠體內(nèi)和體外模型，觀察超抗原SEA反復刺激誘導無能T細胞的規(guī)律和特點。 方法：①在體外，用MTT法測定間隔48h多次SEA刺激后的脾淋巴細胞的增殖反應；在體內(nèi)，間隔不同天數(shù)反復注射SEA后，通過FACS檢測脾淋巴細胞中CD3 的表達。②通過FACS分析SEA反復刺激后，體內(nèi)外淋巴細胞膜表型CD4、CD8、CD69 和CD25 的變化。③測定細胞培養(yǎng)上清或血清中細胞因子（IL-2、TNF-

8、α、IFN-γ、IL-4 和IL-10、）的水平，及細胞內(nèi)IL-2 和IL-10 的陽性百分率。④在不同時間點，SEA再刺激體外或體內(nèi)誘導的無能T細胞，通過MTT法的測定觀察其反應性的恢復情況。 結果：①經(jīng)SEA初次刺激后的體內(nèi)或體外培養(yǎng)的T細胞，對SEA的再刺激仍顯示有繼續(xù)增殖的能力。在體外，刺激T細胞第二次增殖的SEA最佳濃度為100ng/ml。與SEA初次刺激相比，細胞膜表型CD8 表達上升的幅度顯著高于CD4，CD69

9、的表達沒有明顯上升，但仍保持在較高的水平；細胞因子IL-4和IL-10 的含量均顯著升高。在體內(nèi)，間隔不同的天數(shù)，SEA體內(nèi)第二次注射均可引起CD3 表達升高。間隔3 天組中，SEA的再注射主要促進了CD4 表達的上升；間隔28 天組中CD4 和CD8 的表達均有上升，且趨勢相近。與SEA初次注射相比，血清及細胞內(nèi)IL-2 的水平仍有小幅度的遞增，IL-10 水平則顯著上升。體內(nèi)外，連續(xù)兩次SEA刺激均能導致CD25 不同程度的表達升高

10、。②在體外，T細胞受間隔48h連續(xù)三次SEA刺激后，無明顯的增殖反應；CD4 和CD8 的表達沒有繼續(xù)上升；CD69 的表達顯著下降；而CD25 的表達在末次刺激后48h內(nèi)保持在較高的水平。在體內(nèi)，間隔不同天數(shù)的SEA連續(xù)三次注射后，小鼠脾淋巴細胞中CD3 的表達均有不同程度的下降。各組中CD8 的表達水平基本相似，CD4 和CD25 卻有明顯的不同：間隔3 天組中，CD4 的表達在末次注射后3 天內(nèi)明顯降低；CD25 沒有上升的趨勢，

11、但在末次注射后3天內(nèi)仍保持一定水平的表達。間隔28 天組中，CD4 的表達較穩(wěn)定，沒有顯著的升降；CD25 的表達水平較低。體內(nèi)外均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SEA多次刺激后，僅IL-10的水平仍繼續(xù)上升。③體外培養(yǎng)的無能T細胞在7 天內(nèi)幾乎沒有增殖能力，21 天后增殖能力顯著提高，接近正常水平。在體內(nèi)，間隔3 天組和間隔28天組中誘導的無能T細胞分別從末次注射后第21 天和第28 天開始出現(xiàn)較弱的應答反應。 結論：①首次在C57BL/6 小鼠體

12、內(nèi)外成功建立了無能T細胞模型。但體內(nèi)外誘導的無能T細胞經(jīng)過一段時間的休息，其應答反應是可以逐漸恢復的。②經(jīng)SEA初次刺激的T細胞，對SEA的再刺激，仍具有潛在的增殖反應。在體外，SEA的第二次刺激主要促進CD8 亞群的增殖；在體內(nèi)，首次證實間隔較短時間的連續(xù)兩次SEA注射主要促進了CD4 亞群的增殖，而間隔較長時間的兩次SEA注射則對CD4 和CD8 亞群產(chǎn)生相似的增殖效果。③在體內(nèi)實驗中，首次證實了注射間隔時間的長短與無能的觸發(fā)無關，

13、但影響了CD4 亞群的克隆清除，即間隔時間越短，被清除的CD4+T細胞越多；間隔時間越長，CD4+T細胞清除的程度越小。④在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，盡管CD25 的高表達與無能的誘導密切相關，但不是絕對的，即在CD25 低表達的情況下也可觸發(fā)T細胞無能，并且CD25可能不參與無能狀態(tài)的維持。⑤體內(nèi)外試驗均證實IL-10 水平的升高與誘導T細胞無能密切相關，還可能與無能T細胞的維持有關。 3.超抗原SEA誘導小鼠體內(nèi)外T細胞無能過程中CD

14、28/CTLA-4的變化 目的：在超抗原SEA 誘導小鼠體內(nèi)外T 細胞無能的過程中，觀察CD28和CTLA-4 變化規(guī)律及相互關系。方法：SEA 體內(nèi)或體外單次或多次刺激小鼠脾淋巴細胞后，通過FACS 檢測細胞膜表面CD28 和CD152（CTLA-4）陽性表達率，及胞內(nèi)CTLA-4 的表達。結果：體外和體內(nèi)的結果相似，SEA 初次刺激后，CD28 的表達顯著上升；而CTLA-4 在胞內(nèi)和膜表面的表達均低。 SEA再次刺

15、激后，CD28 的表達繼續(xù)上升；CTLA-4 的表達明顯增加，胞內(nèi)CTLA-4 的升高尤為顯著。SEA 連續(xù)三次刺激后，CD28的表達顯著降低；CTLA-4 在膜表面和胞內(nèi)的表達均開始下降。 結論：CTLA-4 的負調(diào)節(jié)作用限制了CD28 的表達，抑制T 細胞的繼續(xù)活化，有利于無能的誘導；但CTLA-4在SEA 反復刺激后的表達下調(diào)，提示其可能不參與無能T 細胞的維持。 上述研究顯示，超抗原SEA 誘導的機體免疫反應是一