PRL-3介導的RhoA-ROCK信號轉(zhuǎn)導通路對異位子宮內(nèi)膜細胞遷徙的調(diào)控作用研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及官體肌層以外的其他部位。它一種常見良性婦科疾患，卻有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等惡性行為，嚴重影響婦女的身心健康、生活質(zhì)量和生育能力。關(guān)于其發(fā)病機制眾說紛紜，目前仍以種植學說為主導理論，但子宮內(nèi)膜細胞如何脫離起源位置并完成宮腔外異位粘附-侵襲-血管形成等復雜過程，特別是細胞如何接收內(nèi)外信號引起細胞遷移這一關(guān)鍵性步驟及其調(diào)控因子尚未闡明。而這

2、一關(guān)鍵性步驟直接導致了子宮內(nèi)膜細胞的遷徙及EMs復發(fā)，所以有必要對子宮內(nèi)膜細胞遷徙及調(diào)控機制進行深入研究探討。
　　 肝再生磷酸酶-3(Phosphatase of Regenerating Liver-3，PRL-3)是肝再生磷酸酶家族中的一員，因近年發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移有非常密切的關(guān)系而備受關(guān)注。自2001年Saha等發(fā)現(xiàn)PRL-3與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系以來，越來越多的研究表明：PRL-3的高表達似乎是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程(特別是

3、轉(zhuǎn)移過程)中的一個共性事件，它能激活細胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導通路，誘導細胞增殖和分化、提高其浸潤轉(zhuǎn)移能力、誘導血管新生，從而促進腫瘤的形成及腫瘤細胞向其他組織器官的轉(zhuǎn)移等。最近研究顯示：在促進腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，PRL-3作為一個上游信號與特定的蛋白結(jié)合，開啟下游Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路，最終導致細胞增殖、遷移等能力的改變。已有研究表明RhoA和ROCK在異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞高表達，而有關(guān)PRL-3與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系國內(nèi)外尚無研究報道

4、。
　　 基于上述的研究背景，我們設(shè)計了本課題，首先從臨床組織水平利用免疫組化、蛋白印跡(Western Blot)技術(shù)，比較PRL-3在EMs患者異位、在位子宮內(nèi)膜及非EMs患者子宮內(nèi)膜的表達，探討PRL-3異常表達與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性；然后從細胞分子水平原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，建立離體細胞遷徙模型，運用劃痕實驗、transwell細胞遷徙浸潤實驗比較異位、在位、非EMs子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的遷徙能力，并用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚

5、合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)、Western Blot方法比較三種細胞中PRL-3、總-RhoA(T-RhoA)、磷酸化-RhoA(P-RhoA)及ROCK基因的表達差異；最后用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾沉默PRL-3基因，并用real-time RT-PCR、Western Blot方法比較轉(zhuǎn)染前后PRL-3、T-RhoA、P-RhoA及ROCK基因表達變化，再利用激光掃描共聚焦顯微鏡、劃痕實驗、transw

6、ell細胞遷徙實驗等技術(shù)，了解轉(zhuǎn)染后異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的細胞骨架及遷徙能力的改變，深入研究PRL-3介導的RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路對異位內(nèi)膜細胞遷徙的調(diào)控作用及其分子機制，從而進一步揭示EMs發(fā)生發(fā)展機制，為該病的防治提供一種新的思路。
　　 第一部分：PRL-3異常表達與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究
　　 目的：
　　 探討PRL-3異常表達與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性。
　　 方法：
　　

7、選取70例異位、在位子宮內(nèi)膜組織及30例非EMs患者子宮內(nèi)膜組織用于免疫組化研究，并隨訪3年；選取35例異位和在位子宮內(nèi)膜組織及20例非EMs患者子宮內(nèi)膜組織用于蛋白印跡檢測，比較PRL-3蛋白在異位、在位及非EMs患者子宮內(nèi)膜組織中的表達差異。
　　 結(jié)果：
　　 免疫組化染色顯示：PRL-3蛋白表達主要定位于異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞以及成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等間質(zhì)細胞的胞膜、胞漿，70例異位子宮內(nèi)膜標本中有51例PR

8、L-3蛋白陽性表達，陽性率為72.9％，而在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜PRL-3蛋白陰性表達，PRL-3在異位子宮內(nèi)膜組織的表達明顯高于在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜，差異有顯著性(P＜0.001)；早期Ⅰ/Ⅱ患者PRL-3蛋白陽性率53.3％(16/30)，而晚期Ⅲ/Ⅳ患者PRL-3蛋白陽性率87.5％(35/40)，兩者間有顯著性差異(P＜0.01)；復發(fā)組PRL-3蛋白陽性率90.0％(18/20)較未復發(fā)組PRL-3蛋白陽性率66.0

9、％(33/50)高，差異有顯著性(P＜0.05)。經(jīng)WesternBlot方法檢測發(fā)現(xiàn)：35例異位子宮內(nèi)膜組織中有29例PRL-3蛋白陽性表達，陽性率為82.9％，而在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜組織中未檢測出PRL-3蛋白表達，異位子宮內(nèi)膜組織PRL-3蛋白表達明顯高于在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜，有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 PRL-3蛋白在異位子宮內(nèi)膜的表達明顯高于在位及非EMs患者子宮內(nèi)膜，并且

10、與EMs的分期及復發(fā)密切相關(guān)。
　　 第二部分：比較三種子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞遷徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路表達
　　 目的：
　　 體外原代培養(yǎng)異位、在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，比較三種子宮內(nèi)膜問質(zhì)細胞遷徙能力及PRL-3/RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路表達差異。
　　 方法：
　　 體外原代培養(yǎng)異位、在位、非EMs患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，建立離體細胞遷徙模型并鑒定間質(zhì)細胞

11、，運用劃痕實驗、transwell細胞遷徙浸潤實驗比較三種細胞的遷徙能力；采用real-timeRT-PCR、WesternBlot方法比較三種細胞中PRL-3、T-RhoA、P-RhoA及ROCK基因的表達差異。
　　 結(jié)果：
　　 transwell實驗顯示，相同時間內(nèi)穿越Matrigel基質(zhì)膠遷移浸潤的異位，在位及非EMs子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞數(shù)分別為：4.13±0.81、2.65±1.07、1.45±0.39，經(jīng)方差分

12、析三組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=107.93，P＜0.05)，經(jīng)SNK法分析異位組與在位組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在位組與非EMs組之間比較也有顯著性差異(P＜0.05)；細胞劃痕實驗同樣顯示相同時間內(nèi)異位子宮內(nèi)膜細胞遷徒能力強于在位子宮內(nèi)膜細胞，而在位子宮內(nèi)膜細胞又強于非EMs患者子宮內(nèi)膜細胞。經(jīng)WesternBlot檢測分析發(fā)現(xiàn)，異位子宮內(nèi)膜細胞PRL-3蛋白相對表達量為0.245±0.132，而在位及非EMs子官內(nèi)

13、膜組未檢測出PRL-3蛋白表達，經(jīng)方差分析三組細胞PRL-3蛋白相對表達量有顯著性差異(F=362.84，P＜0.01)。經(jīng)WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)T-RhoA、P-RhoA、Rock蛋白在異位子宮內(nèi)膜細胞的表達最強，在位子宮內(nèi)膜細胞中表達次之，而在非EMs患者子宮內(nèi)膜細胞表達最弱(P＜0.05)。而real-timeRT-PCR檢測PRL-3、RhoA、Rock的mRNA表達，同樣發(fā)現(xiàn)在異位子官內(nèi)膜細胞的表達最強，在位子宮內(nèi)膜細

14、胞中表達次之，而在非EMs患者子宮內(nèi)膜細胞表達最弱(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的遷徙能力：異位＞在位＞非EMs患者子宮內(nèi)膜；
　　 2.PRL-3/RhoA/ROCK信號通路的表達：異位＞在位＞非EMs患者子宮內(nèi)膜。
　　 第三部分：PRL-3介導的RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路對異位子宮內(nèi)膜細胞遷徙的調(diào)控作用研究
　　 目的：
　　 通過siRNA技術(shù)干擾

15、沉默PRL-3基因，深入研究PRL-3介導RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路對異位內(nèi)膜細胞遷徙的調(diào)控作用及其分子機制。
　　 方法：
　　 體外原代培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞建立離體遷徙模型，用PRL-3siRNA轉(zhuǎn)染異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，采用real-timeRT-PCR、WesternBlot方法檢測PRL-3、T-RhoA、P-RhoA及ROCK基因在轉(zhuǎn)染前后的表達變化；運用劃痕實驗、transwell實驗等觀察轉(zhuǎn)染前后

16、細胞遷徙能力的變化；并通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細胞骨架構(gòu)型的改變。
　　 結(jié)果：
　　 轉(zhuǎn)染后72h實驗組、陰性對照組及空白對照組PRL-3的蛋白相對表達量為0.049±0.052、0.364±0.128、0.418±0.090,經(jīng)方差分析三組間PRL-3蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=343.47，P＜0.05)，經(jīng)SNK法檢驗實驗組與兩對照組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩對照組之間的差異

17、無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；PRL-3siRNA轉(zhuǎn)染0-72h后PRL-3、T-RahoA、P-RhoA、Rock基因的蛋白表達呈下降趨勢，尤以PRL-3下降最為明顯，并且在轉(zhuǎn)染最初的24～48h這種抑制作用最為迅速、明顯，72h抑制率可達到81.4％，而且P-RhoA的變化趨勢與PRL-3較為一致，經(jīng)檢驗轉(zhuǎn)染組與兩對照組相比各基因蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩對照組之間無明顯差異(P＞0.05)；轉(zhuǎn)染0～72h后P

18、RL-3，RhoA、Rock基因mRNA的表達亦呈下降趨勢，在轉(zhuǎn)染最初的24～48h下降最為迅速，經(jīng)檢驗轉(zhuǎn)染組與兩對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩對照組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 當對照組的培養(yǎng)基作用于血清饑餓的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞后。細胞形成明顯的板狀偽足，而實驗組經(jīng)PRL-3siRNA干擾后細胞中未能見到典型的板狀偽足。transwell實驗顯示，相同時間內(nèi)穿越Matrigel遷移浸潤的實驗組、陰

19、性對照組和空白對照組細胞數(shù)分別為：0.87±0.21、1.63±0.39、1.75±0.28，經(jīng)方差分析三組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=103.69，P＜0.05)，經(jīng)SNK法分析實驗組與兩對照組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后實驗組異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中應(yīng)力纖維數(shù)目明顯增多、變粗而清晰，而細胞的絲狀、板狀偽足卻明顯減少。
　　 結(jié)論：<