人參總皂苷對K562細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究.pdf

1、白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是由于造血干細(xì)胞增殖分化異常而導(dǎo)致的。迄今，白血病的治療仍主要采用大劑量聯(lián)合化療與放療，此療法副作用甚大，復(fù)發(fā)率高，尤其對機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大損害。在眾多的研究中，中藥以其增強(qiáng)免疫功能、功補(bǔ)兼施、毒副作用小、注意整體、應(yīng)用范圍廣泛的優(yōu)越性得到了廣泛認(rèn)可和重視。從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中尋找出既能促進(jìn)正常造血又能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖的天然中藥，已成為治療白血病的希望和重要途徑。 目的：本

2、課題組前期研究已證明人參總皂苷（Total saponins of pannax ginseng，TSPG）既能促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞增殖分化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)又能抑制白血病細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和向較成熟細(xì)胞分化，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究表明JAK2激酶及其下游信號蛋白分子-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）對細(xì)胞增殖抑制及定向紅系在EPO介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。本研究采用研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，選擇JAKs/STATs通路探

3、討TSPG參與造血調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)一步闡述TSPG調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖分化的生物學(xué)機(jī)理，為發(fā)現(xiàn)與尋找TSPG調(diào)控白血病細(xì)胞增殖、分化或凋亡的分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，臨床治療血液學(xué)疾病提供指導(dǎo)。 方法：1、采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測TSPG對K562細(xì)胞增殖的影響；2、血紅蛋白測定（分光光度法）檢測經(jīng)TSPG誘導(dǎo)后K562細(xì)胞的血紅蛋白含量變化；3、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察TSPG作用K562細(xì)胞后JAK2的分布；4、激光

4、共聚焦顯微鏡觀察TSPG作用K562細(xì)胞后STAT5的分布；5、實(shí)驗(yàn)分組：陰性對照組，常規(guī)方法培養(yǎng)；Hemin組：常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入Hemin，終濃度30μmol/L；TSPG組，常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加不同濃度TSPG；TSPG+AG490組：TSPG與AG490的終濃度分別是200mg/L和100μmol/L，各組K562細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后收集細(xì)胞，Western blotting法檢測JAK2、STAT5、STAT3、STAT1及P-JA

5、K2、P-STAT5、P-STAT3的變化。 結(jié)果：1、TSPG對K562細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，抑制強(qiáng)度與TSPG的劑量和作用時(shí)間密切相關(guān)；2、經(jīng)TSPG作用后K562細(xì)胞被阻滯在S期，且G0/G1％增加，提示TSPG作用于細(xì)胞周期使K562細(xì)胞增殖抑制；3、經(jīng)TSPG誘導(dǎo)后K562細(xì)胞的血紅蛋白合成量提高；4、免疫細(xì)胞化學(xué)染色：用JAK2抗體顯示K562細(xì)胞JAK2表達(dá)，可見對照組和TSPG組K562細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色，J

6、AK2在上述兩組的分布無明顯差異；5、激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，K562細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均可見STAT5熒光，TSPG200mg/L作用K562細(xì)胞24h，細(xì)胞核內(nèi)STAT5熒光強(qiáng)度明顯減弱；6、Western blotting結(jié)果顯示，TSPG（200mg/L）作用K562細(xì)胞24h，漿蛋白中STAT5表達(dá)較對照組增加，核蛋白中STAT5表達(dá)則減少；作用24h、48h、72h，細(xì)胞總蛋白中JAK2、STAT1、STAT3、STAT5

7、的表達(dá)無明顯變化；作用24h，STAT5酪氨酸磷酸化較對照組明顯減弱，作用48h Phospho-STAT5條帶微弱不能觀察到，而作用72h可見STAT5酪氨酸磷酸化與對照組比較無明顯差異；作用24h可見Phosphor-JAK2條帶，較對照組增強(qiáng)；作用48h與對照組比較STAT3酪氨酸磷酸化顯著增強(qiáng)，作用24h和72h Phospho-STAT3條帶微弱不能觀察到。 TSPG（200mg/L）與AG490（100μmol/L

8、）協(xié)同作用K562細(xì)胞24h、48h、72h，細(xì)胞總蛋白中JAK2、STAT1、STAT3、STAT5的表達(dá)無明顯變化；作用24h、48h Phospho-STAT5條帶微弱不能觀察到，作用72h可見Phospho-STAT5條帶，與對照組和TSPG組比較均明顯減弱；作用48h與對照組和TSPG組比較，STAT3酪氨酸磷酸化有顯著差異。 結(jié)論：TSPG在體外對K562細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并能誘導(dǎo)其向紅系細(xì)胞分化；在JAK2