Wip1基因在結(jié)直腸癌、乳腺癌中的表達(dá)及其慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建對乳腺癌細(xì)胞生長的影響.pdf

1、近年來，我國結(jié)直腸癌及乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢。Wip1是到目前為止，人們最新發(fā)現(xiàn)一種原癌基因，通過一系列的研究證明，在多種腫瘤細(xì)胞中，Wip1的表達(dá)量很高，在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。已經(jīng)證明它在多種腫瘤中存在高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤生長，許多研究表明，以Wip1為靶點的基因治療，能夠在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，延緩腫瘤生長。其在腫瘤發(fā)生免疫系統(tǒng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但目前我們對其的研究仍不夠全面，Wip1有望成為治療

2、惡性腫瘤的新靶點。
　　通過數(shù)據(jù)分析，結(jié)合結(jié)直腸癌和乳腺癌過去幾十年的治療經(jīng)驗，總體來講，結(jié)直腸癌生存率基本維持在44％-56％之間，乳腺癌的5年生存率在60％-80％之間。生存率并沒有隨著發(fā)病率的上升而發(fā)生較大的變化。目前，結(jié)直腸癌和乳腺癌手術(shù)后，患者的預(yù)后主要通過腫瘤病理分期進(jìn)行預(yù)后的預(yù)測，但實際上，影響患者預(yù)后的因素較多，比如患者的年齡、腫瘤的位置和分期、腫瘤的大小和惡性程度等。并且，即使處于同一腫瘤分期，患者的預(yù)后也相同很

3、大。有的患者術(shù)后生存期長，有的則比較短，可見患者預(yù)后受很多未知因素的影響。
　　本研究以2002年1月至2007年1月在唐山工人醫(yī)院腫瘤外科收治的接受手術(shù)治療經(jīng)病理確診隨訪資料完整的120例結(jié)直腸癌、120例乳腺癌患者作為研究對象，通過復(fù)習(xí)病案搜集結(jié)手術(shù)患者的病例因素和臨床特征，其主要目的是深入了解患者的臨床特征，并根據(jù)這些特征探尋影響預(yù)后生存率的因素。使患者更加的清楚預(yù)后影響生存率的因素，加強患者的癌癥信息和防癌意識，從根本上實

4、現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療的方針，為后續(xù)的治療提供理論依據(jù)，旨在促進(jìn)患者生存率的提高。
　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是由于原癌基因激活或者高水平表達(dá)導(dǎo)致的。目前，對于腫瘤的基因治療主要是通過RNA干擾技術(shù)，拮抗基因的表達(dá)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，探討Wip1基因在腫瘤細(xì)胞增殖中的作用，從而實現(xiàn)腫瘤生長抑制的目的，以期為腫瘤的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　本學(xué)位論文涉及的研究內(nèi)容主要包括三部分:
　　第一部分:原癌基因Wip

5、1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，其對結(jié)直腸癌臨床病理分期及預(yù)后的影響
　　目的:Wip1可能參與了結(jié)直腸的發(fā)生和發(fā)展，但其作用機制尚不明確。本文探討其對結(jié)直腸癌發(fā)病的影響，觀察Wip1在不同級別、不同類型人結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá)情況。
　　方法:
　　1病例采集:收集唐山工人醫(yī)院2002年1月至2007年1月手術(shù)切除的120例新鮮結(jié)直腸癌組織，分別于腫瘤組織及距腫瘤邊緣5厘米以上（鏡下未見癌）的正常大腸組織處取材。經(jīng)手術(shù)

6、切除結(jié)直腸癌蠟塊標(biāo)本作為實驗組，標(biāo)本性質(zhì)均被病理結(jié)果證實，共120例。男66例，女54例，中位年齡57.6歲，結(jié)腸癌68例，直腸癌52例。
　　2采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）、半定量RT-PCR方法和WesternBlot分別檢測120例新鮮結(jié)直腸癌組織、正常結(jié)直腸組織中Wip1 mRNA和蛋白表達(dá)情況，分析Wip1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的關(guān)系。并與患者的臨床病例資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化:Wip

7、1蛋白在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)率為85％(102/120)，高于正常大腸組織30％(36/120)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、Western Blot:兩種組織蛋白相對含量分別為1.060±0.02，0.640±0.023。結(jié)直腸癌組織比正常大腸組織明顯升高(P＜0.05)。
　　3、半定量RT-PCR:兩種組織Wip1 mRNA的基因表達(dá)值分別為:1.113±0.018，0.658±0.036。結(jié)直腸癌

8、組織比正常大腸組織明顯升高(P＜0.05)。
　　4、Wip1的表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤部位均無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、組織學(xué)分級及肝轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。
　　5、Wip1表達(dá)與預(yù)后:Wip1低表達(dá)組病例的的5年生存率、無復(fù)發(fā)生存率明顯高于Wip1高表達(dá)組。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)過免疫組織化學(xué)方法（SP法）、半定量PCR和Western Blot分別檢測120例新鮮結(jié)直腸癌組織

9、、正常大腸組織中Wip1 mRNA和蛋白表達(dá)情況，顯示結(jié)直腸癌組織比正常大腸組織明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。且Wip1低表達(dá)組患者生存率較高。
　　第二部分:原癌基因Wip1在乳腺癌中的表達(dá)，其對乳腺癌臨床病理分期及預(yù)后的影響
　　目的:觀察乳腺癌患者臨床分期、預(yù)后的相關(guān)因素及與Wip1表達(dá)量的關(guān)系。
　　方法:
　　收集唐山工人醫(yī)院2005年1月至2010年1月手術(shù)切除的120名患者，分別于腫瘤組織及距腫瘤邊

10、緣5厘米處取材。經(jīng)手術(shù)切除乳腺癌蠟塊標(biāo)本作為實驗組，標(biāo)本均被病理證實，共120例。均為女性，中位年齡51.2歲。依據(jù)TNM分期分類，Ⅰ期59例，Ⅱ期42例，Ⅲ期19例。采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）、實時定量熒光PCR和Western Blot分別檢測120例新鮮乳腺癌組織、正常乳腺組織中Wip1 mRNA和蛋白表達(dá)情況，分析Wip1表達(dá)與乳腺癌患者的關(guān)系。并與患者的臨床病例資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、臨床基本

11、資料:
　　所有的患者臨床標(biāo)本都經(jīng)過唐山工人醫(yī)院病理科診斷為乳腺癌，120例乳腺癌患者中，全部為散發(fā)病例，無家族病史，平均年齡為51.2±27.3歲，其中最小的為23歲，最大的為70歲。均為女性患者。
　　2、Wip1免疫組化染色結(jié)果:正常乳腺組織細(xì)胞中，Wip1免疫組化染色陰性或微弱。乳腺癌組織中Wip1染色呈淺黃色至黃褐色不等。Wip1蛋白在乳腺癌組織的陽性表達(dá)率為80％(96/120)，高于正常大腸組織26.7％(32

12、/120)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、Wip1蛋白在乳腺癌組織、癌旁組織Western blot結(jié)果:Wip1蛋白在乳腺癌組織的相對含量為:0.885±0.079高于癌旁組織的:0.251±0.027，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、各樣品實時定量熒光PCR結(jié)果:Wip1 mRNA表達(dá)在乳腺癌組織高于癌旁組織，基因表達(dá)值分別為:0.835±0.076和0.245±0.021，兩組

13、之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、Wip1的表達(dá)水平與年齡、雌孕激素狀態(tài)、HER2、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期均無關(guān)(P＞0.05)，與P53表達(dá)水平存在關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、乳腺癌中Wip1表達(dá)量高，而癌旁組織表達(dá)量低。
　　2、Wip1的表達(dá)水平與年齡、雌孕激素狀態(tài)、HER2、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期均無關(guān)，與P53表達(dá)水平存在關(guān)聯(lián)。
　　3、乳腺癌3年總生存率Wip

14、1高表達(dá)組與低表達(dá)組差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第三部分:Wip1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的影響
　　目的:本研究通過構(gòu)建干擾Wip1表達(dá)的慢病毒載體，建立穩(wěn)定的細(xì)胞系以觀察其對乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的影響。
　　方法:以慢病毒感染方法將Wip1基因的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)轉(zhuǎn)入乳腺癌MCF-7細(xì)胞，采用qRT-PCR和蛋白印記法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞Wip1的mRNA、蛋白表

15、達(dá)，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-shRNA對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡、周期及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-shRNA后MCF-7細(xì)胞Wip1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯受抑:RT-PCR結(jié)果顯示，Wip1 mRNA在MCF-7/shWip1細(xì)胞、MCF-7/NC細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.211±0.025、0.954±0.090，兩細(xì)胞之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

16、0.05)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，Wip1蛋白相對表達(dá)量分別為0.203±0.021、0.963±0.092，兩細(xì)胞之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、細(xì)胞生物學(xué)功能實驗證實，Wip1-shRNA轉(zhuǎn)染后與空載體組相比，MCF-7細(xì)胞增殖能力明顯減弱，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞G0+G1期增加，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱(P＜0.05)。
　　3、Wip-shRNA對MCF-7細(xì)胞P53蛋白表達(dá)影響:Wip-shRN

17、A轉(zhuǎn)染后，MCF-7/NC細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的相對量為0.765±0.067，MCF-7/shWip1細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的相對量為0.315±0.033。兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1、RNA干擾可有效抑制MCF-7細(xì)胞Wip1表達(dá)。
　　2、Wip1可能通過調(diào)控蛋白表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期與侵襲轉(zhuǎn)移。
　　3、MCF-7/shWip1細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)量降低。