尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物對人結(jié)腸癌細胞的實驗研究及對PI3K-Akt信號通路的影響.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見惡性腫瘤之一，在2000年，全世界大約有90萬新診斷病例，其中49萬死于該病。結(jié)直腸癌占每年新診斷腫瘤病例的10～15%。結(jié)直腸癌在我國，特別是大城市的發(fā)病率以年均4.2%的速度遞增。診斷為早期的患者通?？梢酝ㄟ^外科手術(shù)得到治愈，然而40%～50%患者在臨床確診時已處于局部進展或遠處轉(zhuǎn)移，因此失去手術(shù)治療機會，無法切除的轉(zhuǎn)移病灶又是導致轉(zhuǎn)移和復發(fā)的主要原因，對這些患者，輔助治療和姑息治療是提高療效、改善生存質(zhì)量的有效治療

2、手段。主要包括以氟尿嘧啶、伊立替康及奧沙利鉑為基礎的治療。然而當患者對這些化療藥物產(chǎn)生耐藥后，治療效果明顯下降，需要新的化療藥物及治療方法來提高療效。近年來，分子靶向藥物的應用為結(jié)直腸癌的治療提供了新的途徑并取得了重大進展。 EGFR是酪氨酸激酶生長因子受體家族重要成員，通過與配體結(jié)合后引起受體構(gòu)象改變，胞內(nèi)酪氨酸激酶的活化，蛋白質(zhì)磷酸化和刺激多種細胞信號傳導通路，如motigen-activated protein kina

3、ses（MAPK）和phosphatidyl-inositol-3 kinase（PI3K/AKT）通路，引起基因轉(zhuǎn)錄和細胞周期變化，從而引起下游一系列信號通路的活化，這些通路的激活最終會導致細胞的增殖、逃避凋亡及癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路不僅與細胞的增殖、凋亡有關，而且在腫瘤的生長、對化療的反應方面都扮演著重要角色。特異性抑制PI3K/Akt通路的活性可減少腫瘤細胞的化療耐藥性，通路抑制劑聯(lián)合化療可增強化療

4、效果，這提示了PI3K/Akt通路可作為腫瘤治療的潛在靶點。結(jié)直腸癌患者常伴有EGFR的高表達（25～80%），并往往提示預后不良，針對EGFR的抗體的研究及應用，是近年來腫瘤學研究的熱點，西妥昔單抗是人-鼠單克隆嵌合抗EGFR抗體，單藥及聯(lián)合化療或聯(lián)合放療在臨床治療中已展現(xiàn)出令人滿意的結(jié)果，有效地提高了進展期結(jié)直腸癌患者的中位生存期。多項臨床研究顯示西妥昔單抗（Cetuxizu-mab，C-225）能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。然而，大

5、量的臨床研究結(jié)果顯示，C-225的療效與腫瘤細胞的EGFR表達情況沒有明顯的相關性，而臨床上也不能將EGFR的表達情況作為判斷患者是否適合接受C-225治療、以及對療效進行預測的指標[11，12，13]。 與西妥昔單抗相似的，尼妥珠單抗（Nimotuzumab，h-R3）是一種特異性結(jié)合EGFR胞外結(jié)構(gòu)域的人源化單克隆抗體，以高度人源化、高選擇性、半衰期更長而受到廣泛的關注。臨床前研究證實可以阻斷EGFR與其配體的結(jié)合，并對EG

6、FR過度表達的腫瘤具有抗血管生長、抗細胞增殖和促進凋亡的作用。Amil Shah等進行的II期臨床研究表明，h-R3聯(lián)合伊利替康對伊利替康耐藥的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌顯示有效。加拿大14個臨床研究中心開展的h-R3聯(lián)合伊利替康治療伊利替康耐藥的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床研究得出，h-R3能夠逆轉(zhuǎn)化療的耐藥，伊利替康治療失敗的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，接受h-R3聯(lián)合伊利替康治療，生存獲益顯著。但目前尚無與其他化療藥物聯(lián)合在結(jié)直腸癌治療中的相關實驗數(shù)據(jù)。本研究

7、通過將靶向EGFR的單克隆抗體尼妥珠單抗與治療結(jié)腸癌幾種常用化療藥物聯(lián)合對EGFR表達不同的結(jié)腸癌細胞作用，了解藥物之間的相互作用及對EGFR下游PI3K/Akt信號通路的影響，探討其可能的聯(lián)合作用機制，對臨床及實驗研究提供一定的依據(jù)。 研究目的: 本課題旨在研究分子靶向藥物尼妥珠單抗與化療藥物聯(lián)合對2種EGFR表達情況不同的人結(jié)腸癌細胞體外生長的抑制作用，并探討其療效與EGFR表面表達情況是否相關及可能的效應機制。通過

8、對細胞信號轉(zhuǎn)導相關分子的檢測從細胞信號傳導方面探討二者聯(lián)合的可能分子機制。 研究方法: 第一章尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物對2種人結(jié)腸癌細胞體外生長的抑制作用 1.流式細胞術(shù)檢測兩種結(jié)腸癌細胞LoVo、Colo205表面EGFR表達情況。 2.人結(jié)腸癌細胞體外傳代培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后實驗細胞分為4組：分別為空白對照組、尼妥珠單抗單藥組、化療藥物單藥組（氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑）、尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥

9、物組。檢測細胞增殖抑制率時尼妥珠單抗藥物劑量設6.25、12.5、25、50、75、100μg/ml6個濃度組；CPT-11藥物劑量設6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml6個濃度組；L-OHP設0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/ml6個濃度組；5-Fu設0.25、0.5、1、2、4、8μg/ml6個濃度組；尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物時劑量選擇為50μg/ml，化療藥物劑量仍為以上6個濃度組。 3.以M

10、TT法檢測24、48、72h時間點藥物抑制人結(jié)腸癌細胞增殖的作用，根據(jù)OD值計算細胞生長抑制率。 4.細胞培養(yǎng)同上，用流式細胞儀于尼妥珠單抗作用后24h檢測細胞周期、48h檢測細胞凋亡，并計算凋亡率。 第二章尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物抑制2種人結(jié)腸癌細胞生長機制的初步探討。 1.人結(jié)腸癌細胞體外傳代培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后實驗細胞分為2組：分別為空白對照組、尼妥珠單抗單藥組。尼妥珠單抗藥物劑采用50μg/ml；作

11、用時間為72h。 2.Western-Blot法檢測2種人結(jié)腸癌細胞中PI3K/AKT信號通路各相關分子PTEN、PI3K、AKT、phospho-Akt（Ser473）、c-Raf. GSK-3β及phospho-GSK-3β蛋白表達。 3.PCR法檢測上述信號通路蛋白PTEN、PI3K、AKT、Raf-1及GSK-3β的基因表達水平。 注：統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用

12、均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間細胞半藥抑制濃度（IC50）比較采用重復測量方差分析；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊的采用Tamhane's T2法；兩組比較用獨立樣本t檢驗；顯著性標準為α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果: 第一章尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物對2種人結(jié)腸癌細胞體外生長的抑制作用 1.流式細胞術(shù)測細胞表面EGFR情況，LoVo細胞EGFR呈高水平表達，C

13、olo205細胞呈低水平表達。 2.MTT比色法結(jié)果顯示，不同濃度尼妥珠單抗對兩種人結(jié)腸癌細胞LoVo及Colo205細胞增殖均無明顯殺傷作用，尼妥珠單抗與化療藥物伊立替康、氟尿嘧啶聯(lián)合，不同濃度及作用時間抑制率比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000），單藥伊立替康與聯(lián)合組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000），單藥氟尿嘧啶與聯(lián)合組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000，0.002），而單藥奧沙利鉑與聯(lián)合組之間比較，

14、兩種細胞結(jié)果不同，LoVo細胞兩組比較差異不具有統(tǒng)計學意義（P=0.126），Colo205細胞兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.003）。 3.流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期顯示，單藥尼妥珠單抗可誘導LoVo細胞產(chǎn)生凋亡及引起G0/G1期阻滯，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.025，0.001）；單藥尼妥珠單抗可誘導Colo205細胞產(chǎn)生凋亡及引起G0/G1期阻滯，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.012，

15、0.000）。 第二章尼妥珠單抗聯(lián)合化療藥物抑制人結(jié)腸癌細胞生長機制的初步探討 1.Western-Blot結(jié)果顯示，尼妥珠單抗對兩種細胞均上調(diào)PTEN，能下調(diào)PI3K、p-AKT蛋白表達，進而下調(diào)p-GSK-3β蛋白表達，但總的Akt、c-Raf及GSK-3β蛋白水平無明顯改變。 2.PCR結(jié)果顯示，尼妥珠單抗對LoVo及Colo205均上調(diào)PTEN基因的表達（P=0.001），能下調(diào)PI3K基因的表達（P=0

16、.008，0.000），對總的Akt（P=0.286，0.607）、Raf-1（P=0.847，0.0.760）及GSK-3β（P=0.355，0.572）的基因表達無明顯改變。 結(jié)論: 尼妥珠單抗單獨應用在體外不論對EGFR高表達或EGFR低表達的結(jié)腸癌細胞均無明顯抑制作用，氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑分別單獨應用對兩種細胞均有抑制增殖作用，h-R3能有效提高化療藥物伊利替康與氟尿嘧啶體外對兩種結(jié)腸癌細胞抑制作用的敏感