PI3K-AKT通路的活化與胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼反應(yīng)性的關(guān)系.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  通過(guò)體外研究吉非替尼對(duì)人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系,討論EGFR通路(EGFR、pEGFR)及PI3K/Akt通路(Akt、pAkt)對(duì)吉非替尼療效是否有預(yù)測(cè)價(jià)值,為臨床篩選對(duì)吉非替尼敏感的胰腺癌患者提供體外實(shí)驗(yàn)的理論參考。體外培養(yǎng)對(duì)吉非替尼具有不同敏感性的人胰腺癌細(xì)胞株,使用藥物抑制PI3K/Akt通路的活化,分析不同細(xì)胞株在吉非替尼和PI3K/Akt抑制劑作用下生長(zhǎng)抑制率的變化規(guī)律,探討吉非

2、替尼可能的耐藥機(jī)制,探討pAkt能否作為判斷吉非替尼療效及逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn),為PI3K/Akt抑制劑與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥提供理論依據(jù),并為吉非替尼耐藥人群后續(xù)治療的選擇提供參考。
  方法:
  選取3株突變狀態(tài)不同的人胰腺癌細(xì)胞株:BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1,采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)EGFR、Kras突變。MTT法測(cè)定吉非替尼和LY294002對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線,比較分析不同細(xì)胞株對(duì)

3、吉非替尼及LY294002的敏感性,以及不同LY294002濃度時(shí)各細(xì)胞株對(duì)吉非替尼敏感性的變化情況。對(duì)3株人胰腺癌細(xì)胞分別按照空白對(duì)照組、單藥吉非替尼5μM組、單藥LY29400210μM組、LY29400210μM聯(lián)合吉非替尼5μM組進(jìn)行處理,WesternBlot免疫印跡法測(cè)定各組細(xì)胞EGFR、pEGFR、Akt、pAkt的蛋白表達(dá)量,分析各組藥物對(duì)人胰腺癌細(xì)胞EGFR、Akt蛋白活化的影響的影響。
  結(jié)果:
  1

4、.DNA測(cè)序結(jié)果顯示BxPc-3細(xì)胞EGFR/Kras均為野生型;MiaPaCa-2細(xì)胞EGFR野生型,KrasG12C突變;PANC-1細(xì)胞EGFRT790M突變,KrasG12D突變。
  2.MTT檢測(cè)顯示吉非替尼和LY294002對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1均表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用,隨著藥物濃度的增加,其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng),各組用藥劑量與細(xì)胞生存率之間呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。L

5、Y294002與吉非替尼聯(lián)合,可以增強(qiáng)吉非替尼對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的抑制作用,LY294002劑量越大,增強(qiáng)作用越明顯。BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1細(xì)胞的LY294002IC50分別為(24.65±1.87)μM、(17.04±0.78)μM和(11.32±1.48)μM,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=191.79,P<0.01);單藥吉非替尼IC50分別為(6.34±1.68)μM、(15.41±2.69)μM及(36.67±1.

6、39)μM,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=545.74,P<0.01);LY2940022μM聯(lián)合吉非替尼IC50分別為(3.48±1.75)μM、(5.39±1.87)μM及(11.55±2.49)μM,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.64,P<0.01);LY29400210μM聯(lián)合吉非替尼IC50分別為*(0.66±0.19)μM、*(0.69±0.07)μM及(2.33±0.49)μM,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=87.82,P<0.01,*組間

7、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05)。
  3.Western Blot檢測(cè)顯示在空白對(duì)照組中,吉非替尼敏感細(xì)胞系BxPc-3的EGFR表達(dá)量(1.11±0.21)、活化量(0.81±0.11)及相對(duì)活性(0.73±0.05)最高,Akt表達(dá)量(0.53±0.07)、活化量(0.09±0.11)及相對(duì)活性(0.17±0.12)最低;而吉非替尼高度耐藥細(xì)胞系PANC-1的EGFR表達(dá)量(0.61±0.06)、活化量(0.38±0.04)

8、及相對(duì)活性(0.62±0.07)最低,Akt表達(dá)量(1.51±0.18)、活化量(1.54±0.16)及相對(duì)活性(1.02±0.21)最高。經(jīng)過(guò)吉非替尼單藥處理后,3株細(xì)胞系的EGFR及AKT表達(dá)量并無(wú)明顯變化,但活化量及相對(duì)活性均有下降,敏感株BxPc-3的EGFR相對(duì)活性(0.36±0.05)下降51.22%,Akt相對(duì)活性(0.04±0.03)下降76.91%;高度耐藥株P(guān)ANC-1的EGFR相對(duì)活性(0.61±0.09)僅下降2

9、.05%,Akt相對(duì)活性(0.56±0.10)下降44.96%。LY294002對(duì)3株細(xì)胞pAkt及pEGFR均有明顯抑制作用,并且在與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可以顯著增強(qiáng)吉非替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞EGFR和Akt磷酸化的抑制作用,敏感株BxPc-3的EGFR相對(duì)活性(0.02±0.04)下降97.51%,Akt相對(duì)活性(0.02±0.02)下降87.98%;高度耐藥株P(guān)ANC-1的EGFR相對(duì)活性(0.11±0.04)下降82.71%,Akt相

10、對(duì)活性(0.08±0.05)下降93.42%。
  結(jié)論:
  吉非替尼通過(guò)阻斷EGFR活化,對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1的生長(zhǎng)有抑制作用,PI3K/Akt通路的活化與人胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的反應(yīng)性相關(guān)。pAkt高表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞可能對(duì)吉非替尼耐藥。聯(lián)合應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002可以通過(guò)阻斷PI3K/Akt通路,抑制pAkt活性,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)pAkt高表達(dá)人

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