PI3K-AKT通路的活化與胰腺癌細胞對吉非替尼反應性的關系.pdf

1、目的:
　　通過體外研究吉非替尼對人胰腺癌細胞生長抑制與PI3K/Akt通路之間的關系,討論EGFR通路(EGFR、pEGFR)及PI3K/Akt通路(Akt、pAkt)對吉非替尼療效是否有預測價值,為臨床篩選對吉非替尼敏感的胰腺癌患者提供體外實驗的理論參考。體外培養(yǎng)對吉非替尼具有不同敏感性的人胰腺癌細胞株,使用藥物抑制PI3K/Akt通路的活化,分析不同細胞株在吉非替尼和PI3K/Akt抑制劑作用下生長抑制率的變化規(guī)律,探討吉非

2、替尼可能的耐藥機制,探討pAkt能否作為判斷吉非替尼療效及逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點,為PI3K/Akt抑制劑與吉非替尼聯(lián)合應用逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥提供理論依據(jù),并為吉非替尼耐藥人群后續(xù)治療的選擇提供參考。
　　方法:
　　選取3株突變狀態(tài)不同的人胰腺癌細胞株:BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1,采用Sanger測序法檢測EGFR、Kras突變。MTT法測定吉非替尼和LY294002對細胞的生長抑制曲線,比較分析不同細胞株對

3、吉非替尼及LY294002的敏感性,以及不同LY294002濃度時各細胞株對吉非替尼敏感性的變化情況。對3株人胰腺癌細胞分別按照空白對照組、單藥吉非替尼5μM組、單藥LY29400210μM組、LY29400210μM聯(lián)合吉非替尼5μM組進行處理,WesternBlot免疫印跡法測定各組細胞EGFR、pEGFR、Akt、pAkt的蛋白表達量,分析各組藥物對人胰腺癌細胞EGFR、Akt蛋白活化的影響的影響。
　　結(jié)果:
　　1

4、.DNA測序結(jié)果顯示BxPc-3細胞EGFR/Kras均為野生型;MiaPaCa-2細胞EGFR野生型,KrasG12C突變;PANC-1細胞EGFRT790M突變,KrasG12D突變。
　　2.MTT檢測顯示吉非替尼和LY294002對人胰腺癌細胞系BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1均表現(xiàn)出抑制細胞生長作用,隨著藥物濃度的增加,其對細胞生長的抑制作用逐漸增強,各組用藥劑量與細胞生存率之間呈負相關(p<0.05)。L

5、Y294002與吉非替尼聯(lián)合,可以增強吉非替尼對人胰腺癌細胞的抑制作用,LY294002劑量越大,增強作用越明顯。BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1細胞的LY294002IC50分別為(24.65±1.87)μM、(17.04±0.78)μM和(11.32±1.48)μM,差異有統(tǒng)計學意義(F=191.79,P<0.01);單藥吉非替尼IC50分別為(6.34±1.68)μM、(15.41±2.69)μM及(36.67±1.

6、39)μM,差異有統(tǒng)計學意義(F=545.74,P<0.01);LY2940022μM聯(lián)合吉非替尼IC50分別為(3.48±1.75)μM、(5.39±1.87)μM及(11.55±2.49)μM,差異有統(tǒng)計學意義(F=37.64,P<0.01);LY29400210μM聯(lián)合吉非替尼IC50分別為*(0.66±0.19)μM、*(0.69±0.07)μM及(2.33±0.49)μM,差異有統(tǒng)計學意義(F=87.82,P<0.01,*組間

7、差異無統(tǒng)計學意義,P>0.05)。
　　3.Western Blot檢測顯示在空白對照組中,吉非替尼敏感細胞系BxPc-3的EGFR表達量(1.11±0.21)、活化量(0.81±0.11)及相對活性(0.73±0.05)最高,Akt表達量(0.53±0.07)、活化量(0.09±0.11)及相對活性(0.17±0.12)最低;而吉非替尼高度耐藥細胞系PANC-1的EGFR表達量(0.61±0.06)、活化量(0.38±0.04)

8、及相對活性(0.62±0.07)最低,Akt表達量(1.51±0.18)、活化量(1.54±0.16)及相對活性(1.02±0.21)最高。經(jīng)過吉非替尼單藥處理后,3株細胞系的EGFR及AKT表達量并無明顯變化,但活化量及相對活性均有下降,敏感株BxPc-3的EGFR相對活性(0.36±0.05)下降51.22％,Akt相對活性(0.04±0.03)下降76.91%;高度耐藥株PANC-1的EGFR相對活性(0.61±0.09)僅下降2

9、.05%,Akt相對活性(0.56±0.10)下降44.96%。LY294002對3株細胞pAkt及pEGFR均有明顯抑制作用,并且在與吉非替尼聯(lián)合應用時,可以顯著增強吉非替尼對胰腺癌細胞EGFR和Akt磷酸化的抑制作用,敏感株BxPc-3的EGFR相對活性(0.02±0.04)下降97.51%,Akt相對活性(0.02±0.02)下降87.98%;高度耐藥株PANC-1的EGFR相對活性(0.11±0.04)下降82.71%,Akt相

10、對活性(0.08±0.05)下降93.42%。
　　結(jié)論:
　　吉非替尼通過阻斷EGFR活化,對人胰腺癌細胞系BxPc-3、MiaPaCa-2及PANC-1的生長有抑制作用,PI3K/Akt通路的活化與人胰腺癌細胞對吉非替尼的反應性相關。pAkt高表達的人胰腺癌細胞可能對吉非替尼耐藥。聯(lián)合應用PI3K抑制劑LY294002可以通過阻斷PI3K/Akt通路,抑制pAkt活性,增強細胞對吉非替尼的敏感性,進而逆轉(zhuǎn)pAkt高表達人