Bcl-xl過表達促進氧化損傷后血管內(nèi)皮細胞快速修復的體外實驗研究.pdf

1、背景和目的
　　 血管重建術后內(nèi)膜增生引發(fā)的再狹窄一直是臨床的熱點和難點問題。而血管內(nèi)膜損傷是導致后續(xù)一系列級聯(lián)反應（血小板及炎性細胞粘附活化、平滑肌細胞增殖遷移），并最終引發(fā)再狹窄的首要環(huán)節(jié)。而多種損傷因子（手術、高血糖、高血脂、吸煙、缺血-再灌注等）均可通過氧化應激反應引發(fā)血管內(nèi)皮細胞凋亡進而造成內(nèi)膜損傷。因此，抑制氧化應激導致的血管內(nèi)皮細胞凋亡，增強對血管內(nèi)膜的保護作用可能成為減輕損傷后內(nèi)膜增生的新方法。以往研究中多采用抗

2、氧化藥物以減輕氧化應激介導的細胞凋亡，但系統(tǒng)性給藥難免使損傷局部血藥濃度過低，達不到真正意義上的抗氧化效應。隨著基因治療技術的發(fā)展，血管局部定位基因轉(zhuǎn)染逐步成為防治再狹窄研究的熱點，可將特定基因精確轉(zhuǎn)染至血管壁，最大程度的在局部發(fā)揮作用。本研究在體外臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化損傷模型的基礎上，利用重組腺病毒載體預先將抗凋亡基因Bcl-xl導入內(nèi)皮細胞，研究Bcl-xl過表達可否抑制氧化應激導致的內(nèi)皮細胞凋亡以及對內(nèi)皮細胞功能的保護

3、作用，進而為促進受損內(nèi)皮細胞的快速修復、防止術后管腔再狹窄的基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 內(nèi)容和方法
　　 1、重組腺病毒基因載體的構建
　　 （1）提取目的基因Bcl-xI及構建質(zhì)粒載體pGEM-T-Bcl-xl；
　　 （2）以上述質(zhì)粒載體為模板構建重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-Bcl-xl，同時構建空病毒載體pAdxsi-GFP作為對照；
　　 （3）以不同感染復數(shù)（MOI）的重組腺病

4、毒感染HUVEC，評估感染率，通過Western Blot檢測感染后HUVEC中目的蛋白Bcl-xl的表達情況。
　　 2、Bcl-xl過表達的HUVEC抗氧化捌亡能力及內(nèi)皮細胞相關功能檢測
　　 （1）H2O2誘導HUVEC凋亡模型的建立；
　　 （2）實驗細胞分組：正常HUVEC紐（Normal組）、正常HUVEC+H2O2組（H2O2組）、經(jīng)pAdxsi-GFP-Bcl-xl轉(zhuǎn)染的HUVEC+H2O2組（A

5、dv-GFP-Bcl-xl組）、經(jīng)pAdxsi-GFP轉(zhuǎn)染的HUVEC+H2O2組（Adv-GFP組）；
　　 （3）Bcl-xl過表達的HUVEC抗氧化凋亡能力檢測
　　 通過倒置顯微鏡觀察、Hoechst33258細胞核染色，了解各組在氧化應激刺激下細胞形態(tài)學改變的差異
　　 通過PI染色/流式細胞儀進行細胞周期檢測，得出G0/G1期細胞比例，進而評估凋亡率
　　 通過Western Blot進行凋亡

6、相關蛋白（Caspase-7，PARP）檢測
　　 （4）探索Bcl-xl過表達可否保護氧化應激條件下內(nèi)皮細胞的正常功能
　　 通過CCK-8檢測及細胞免疫組化染色了解細胞增殖能力
　　 通過細胞劃痕試驗了解各組在氧化損傷后的遷移能力上有無差異
　　 通過Real-time PCR檢測氧化損傷后各組細胞內(nèi)eNOS在mRNA水平上的表達差異
　　 通過ELISA檢測各時間點（0h、24h、36h、4

7、8h）每紐細胞培養(yǎng)上清中VEGF的分泌量
　　 結果：
　　 1、重組腺病毒成功感染HUVEC，最適MOI為100。Western Blot結果顯示目的蛋白Bcl-xl高表達于病毒感染后的HUVEC。
　　 2、Bcl-xl過表達增強HUVEC耐受氧化損傷的能力，同時保護了內(nèi)皮細胞功能
　　 （1）成功建立H2O2誘導HUVEC凋亡模型，凋亡率與H2O2濃度具有量效關系；
　　 （2）正常HUVE

8、C在氧化應激條件下細胞形態(tài)發(fā)生改變，同時染色體固縮。而Bcl-xl過表達的HUVEC在形態(tài)上無明顯改變，固縮核細胞比例明顯降低；
　　 （3）Bcl-xl過表達后的HUVEC，處于G0/G1期的細胞比例明顯降低；
　　 （4）Western Blot檢測凋亡相關蛋白結果顯示：H2O2紐及Adv-GFP組細胞在氧化應激下，細胞內(nèi)可檢測到Cleaved caspase-7及Cleaved PARP表達，而Adv-GFP-Bc

9、l-xl組上述蛋白表達量明顯降低；
　　 （5）在細胞增殖方面，H2O2組及Adv-GFP組細胞在氧化應激條件下，細胞倍增速度明顯下降。而Adv-GFP-Bcl-xl組細胞的生長曲線與正常組細胞基本一致。同時Adv-GFP-Bcl-xl紐PCNA陽性細胞比例有所升高；
　　 （6）細胞劃痕試驗結果顯示Adv-GFP-Bcl-xl組劃痕愈合較H2O2組及Adv-GFP組明顯加快，與正常組細胞愈合能力基本一致；
　　

10、 （7）Real-time PCR結果顯示氧化應激刺激后，Adv-GFP-Bcl-xl組較H2O2組及Adv-GFP組細胞內(nèi)eNOS mRNA表達量明顯上調(diào)；
　　 （8）ELISA結果顯示H2O2處理的三組細胞較正常紐細胞VEGF分泌量明顯升高，同時Adv-GFP-Bcl-xl組VEGF分泌量高于H2O2組及Adv-GFP組。
　　 結論：
　　 1、重絹腺病毒對HUVEC具有較高的感染效率，最適MOI為100