Bcl-xl過(guò)表達(dá)促進(jìn)氧化損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞快速修復(fù)的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的
　　 血管重建術(shù)后內(nèi)膜增生引發(fā)的再狹窄一直是臨床的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。而血管內(nèi)膜損傷是導(dǎo)致后續(xù)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)（血小板及炎性細(xì)胞粘附活化、平滑肌細(xì)胞增殖遷移），并最終引發(fā)再狹窄的首要環(huán)節(jié)。而多種損傷因子（手術(shù)、高血糖、高血脂、吸煙、缺血-再灌注等）均可通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而造成內(nèi)膜損傷。因此，抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對(duì)血管內(nèi)膜的保護(hù)作用可能成為減輕損傷后內(nèi)膜增生的新方法。以往研究中多采用抗

2、氧化藥物以減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但系統(tǒng)性給藥難免使損傷局部血藥濃度過(guò)低，達(dá)不到真正意義上的抗氧化效應(yīng)。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展，血管局部定位基因轉(zhuǎn)染逐步成為防治再狹窄研究的熱點(diǎn)，可將特定基因精確轉(zhuǎn)染至血管壁，最大程度的在局部發(fā)揮作用。本研究在體外臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，利用重組腺病毒載體預(yù)先將抗凋亡基因Bcl-xl導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞，研究Bcl-xl過(guò)表達(dá)可否抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)

3、作用，進(jìn)而為促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞的快速修復(fù)、防止術(shù)后管腔再狹窄的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 內(nèi)容和方法
　　 1、重組腺病毒基因載體的構(gòu)建
　　 （1）提取目的基因Bcl-xI及構(gòu)建質(zhì)粒載體pGEM-T-Bcl-xl；
　　 （2）以上述質(zhì)粒載體為模板構(gòu)建重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-Bcl-xl，同時(shí)構(gòu)建空病毒載體pAdxsi-GFP作為對(duì)照；
　　 （3）以不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的重組腺病

4、毒感染HUVEC，評(píng)估感染率，通過(guò)Western Blot檢測(cè)感染后HUVEC中目的蛋白Bcl-xl的表達(dá)情況。
　　 2、Bcl-xl過(guò)表達(dá)的HUVEC抗氧化捌亡能力及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)功能檢測(cè)
　　 （1）H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡模型的建立；
　　 （2）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組：正常HUVEC紐（Normal組）、正常HUVEC+H2O2組（H2O2組）、經(jīng)pAdxsi-GFP-Bcl-xl轉(zhuǎn)染的HUVEC+H2O2組（A

5、dv-GFP-Bcl-xl組）、經(jīng)pAdxsi-GFP轉(zhuǎn)染的HUVEC+H2O2組（Adv-GFP組）；
　　 （3）Bcl-xl過(guò)表達(dá)的HUVEC抗氧化凋亡能力檢測(cè)
　　 通過(guò)倒置顯微鏡觀察、Hoechst33258細(xì)胞核染色，了解各組在氧化應(yīng)激刺激下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的差異
　　 通過(guò)PI染色/流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，得出G0/G1期細(xì)胞比例，進(jìn)而評(píng)估凋亡率
　　 通過(guò)Western Blot進(jìn)行凋亡

6、相關(guān)蛋白（Caspase-7，PARP）檢測(cè)
　　 （4）探索Bcl-xl過(guò)表達(dá)可否保護(hù)氧化應(yīng)激條件下內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能
　　 通過(guò)CCK-8檢測(cè)及細(xì)胞免疫組化染色了解細(xì)胞增殖能力
　　 通過(guò)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)了解各組在氧化損傷后的遷移能力上有無(wú)差異
　　 通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)氧化損傷后各組細(xì)胞內(nèi)eNOS在mRNA水平上的表達(dá)差異
　　 通過(guò)ELISA檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)（0h、24h、36h、4

7、8h）每紐細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的分泌量
　　 結(jié)果：
　　 1、重組腺病毒成功感染HUVEC，最適MOI為100。Western Blot結(jié)果顯示目的蛋白Bcl-xl高表達(dá)于病毒感染后的HUVEC。
　　 2、Bcl-xl過(guò)表達(dá)增強(qiáng)HUVEC耐受氧化損傷的能力，同時(shí)保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞功能
　　 （1）成功建立H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡模型，凋亡率與H2O2濃度具有量效關(guān)系；
　　 （2）正常HUVE

8、C在氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)染色體固縮。而B(niǎo)cl-xl過(guò)表達(dá)的HUVEC在形態(tài)上無(wú)明顯改變，固縮核細(xì)胞比例明顯降低；
　　 （3）Bcl-xl過(guò)表達(dá)后的HUVEC，處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯降低；
　　 （4）Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：H2O2紐及Adv-GFP組細(xì)胞在氧化應(yīng)激下，細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到Cleaved caspase-7及Cleaved PARP表達(dá)，而Adv-GFP-Bc

9、l-xl組上述蛋白表達(dá)量明顯降低；
　　 （5）在細(xì)胞增殖方面，H2O2組及Adv-GFP組細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞倍增速度明顯下降。而Adv-GFP-Bcl-xl組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與正常組細(xì)胞基本一致。同時(shí)Adv-GFP-Bcl-xl紐PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例有所升高；
　　 （6）細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示Adv-GFP-Bcl-xl組劃痕愈合較H2O2組及Adv-GFP組明顯加快，與正常組細(xì)胞愈合能力基本一致；
　　

10、 （7）Real-time PCR結(jié)果顯示氧化應(yīng)激刺激后，Adv-GFP-Bcl-xl組較H2O2組及Adv-GFP組細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)；
　　 （8）ELISA結(jié)果顯示H2O2處理的三組細(xì)胞較正常紐細(xì)胞VEGF分泌量明顯升高，同時(shí)Adv-GFP-Bcl-xl組VEGF分泌量高于H2O2組及Adv-GFP組。
　　 結(jié)論：
　　 1、重絹腺病毒對(duì)HUVEC具有較高的感染效率，最適MOI為100