慢病毒介導(dǎo)的hTERT-shRNA聯(lián)合光動力治療對宮頸癌細(xì)胞SiHa的影響.pdf

1、背景:宮頸癌是全球女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在發(fā)展中國家居首位，僅次于乳腺癌的發(fā)生。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，從宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelial neoplasia, CIN)發(fā)展至浸潤型宮頸癌是個連續(xù)發(fā)展的過程，大約經(jīng)歷10年左右。近年來，由于宮頸液基細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用以及宮頸癌篩查的廣泛普及，使得宮頸癌在癌前病變階段就

2、被識別，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降。傳統(tǒng)的治療方法包括放療、化療和手術(shù)治。光動力治療(photodynamic therapy,PDT)是腫瘤治療的一種新模式，通過光敏劑在病變組織中集聚，然后給予特定波長的激光照射后，釋放大量的活性氧(ROS)，從而破環(huán)腫瘤組織。四甲基吡啶卟啉[meso-5，10，15，20-Tetrakis-(N-methyl-4-pyridyl) porphine，TMPyP4]是一種人工合成的新型水溶性光敏劑

3、，為四價陽離子卟啉化合物，進(jìn)入細(xì)胞后可以定位于細(xì)胞核，結(jié)合并穩(wěn)定端粒序列上的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而抑制端粒酶活性。
　　人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的組成部分(hTERT)作為端粒酶的活性成分，以自身的RNA為模板合成端粒重復(fù)序列，進(jìn)而維持端粒長度，維持染色體的穩(wěn)定性。本研究旨在利用慢病毒作為載體將Lenti-hTERT-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至正常的和接受TMPyP4-PDT的宮頸癌SiHa細(xì)胞株，旨在觀察hTERT在宮頸癌的光動力治療中的作用和

4、可能的機(jī)制，為宮頸癌的臨床治療提供一種新的輔助治療手段。
　　目的:探討hTERT基因干擾對宮頸癌SiHa細(xì)胞株的凋亡、侵襲能力的影響及其在TMPyP4-PDT治療中的可能機(jī)制。
　　方法:利用免疫熒光技術(shù)確定最適感染復(fù)數(shù)(MOI)值，利用PCR和免疫熒光(IF)技術(shù)對hTERT基因的干擾序列進(jìn)行篩選，篩選出干擾效率最高的shRNA序列，并在體外轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞系，用于后續(xù)實驗。選擇宮頸癌SiHa細(xì)胞系，實驗分為4組:

5、空白對照組、單純基因治療組（轉(zhuǎn)染Lenti-hTERT-shRNA）、單純TMPyP4-PDT組、聯(lián)合治療組。CCK-8法檢測各處理組的細(xì)胞增殖活性;AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染試劑盒檢測各組細(xì)胞的凋亡率;Transwell實驗檢測各組細(xì)胞侵襲能力的改變;RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表達(dá);Western Blot檢測Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspas

6、e-8基因蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:最適感染復(fù)數(shù)(MOI)值為20，在4個干擾片段sh-1515、sh-1693、sh-1788、sh-1135中，sh-1693的轉(zhuǎn)染效率最高，用于后續(xù)實驗。CCK-8結(jié)果示:空白對照組、單純基因治療組、單純光動力治療組、聯(lián)合治療組的細(xì)胞存活率依次為（1.0±0.03）％、（0.75±0.02）％、（0.62±0.05）％、（0.19±0.03）％。聯(lián)合治療組的早期/總凋亡率明顯高于其他3組，差

7、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示:聯(lián)合治療組與單純基因治療組和單純光動力治療組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果示:與單純基因治療組和單純光動力治療組相比，聯(lián)合治療組中基因Bcl-2、Caspase-8mRNA的表達(dá)下降，Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果示:Bcl-2、Caspase-8