姜黃素影響HT-29結(jié)腸癌細胞生長、增殖的分子機制研究.pdf

1、姜黃素是從天然植物—姜黃根莖中提取的一種多酚，具有抗氧化、消炎、抗腫瘤、預防老年性癡呆、治療風濕等多種功效。本論文旨在研究姜黃素對HT—29結(jié)腸癌細胞生長、增殖及細胞存活率的影響，并在分子水平上研究姜黃素對HT—29細胞線粒體凋亡途徑、β—catenin/Tcf—4信號途徑活性的影響，從而探討姜黃素抑制細胞生長、增殖的分子機制。
　　 本論文首先用倒置顯微鏡觀察了10—80μM姜黃素處理對HT—29細胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素

2、處理能夠顯著抑制細胞的生長。用Hoechst33258熒光染料染色也發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠誘導HT—29細胞核濃縮，誘導細胞凋亡。對HT—29細胞線粒體膜電位及caspase—3活性的測定表明，10—80μM的姜黃素可以導致線粒體膜電位顯著下降(P＜0.05)，caspase—3的活性顯著提高(P＜0.05)。
　　 為了研究姜黃素抑制HT—29細胞生長增殖，誘導其死亡的分子機理，本研究運用RT—PCR技術(shù)研究了細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)

3、蛋白mRNA的水平，結(jié)果表明，用高于40μM的姜黃素處理HT—29細胞，能夠顯著降低細胞中抗凋亡蛋白Bcl—2、Bcl—XL、survin mRNA的水平(P＜0.05)，促凋亡蛋白Bax mRNA的水平會顯著升高(P＜0.05)，caspase—3 mRNA的水平則沒有顯著變化。Western—blotting結(jié)果則表明，10—80μM的姜黃素可以導致細胞中促凋亡蛋白Bad與Bax的水平顯著升高，凋亡抑制蛋白Bcl—2、Bcl—xL及

4、survivin的水平則明顯下降；40μM以上的姜黃素處理HT—29細胞，可以激活其caspase—3，誘導PARP降解；Western—blotting結(jié)果還表明，10μM以上的姜黃素可以導致HT—29細胞線粒體細胞色素c的釋放。以上結(jié)果表明，姜黃素可能通過線粒體途徑誘導HT—29細胞凋亡。
　　 β—catenin/Tcf—4信號途徑在大多數(shù)結(jié)腸癌細胞中異常激活，該通路可以激活多種原癌基因的表達，促進結(jié)腸癌細胞株生長、分化，

5、為了研究姜黃素是否通過影響該信號途徑的活性，抑制腫瘤細胞生長、分化，并可能誘導其凋亡。本論文用Western—blotting技術(shù)研究了姜黃素對細胞內(nèi)β—catenin水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)е翲T—29細胞內(nèi)β—catenin裂解，從而降低細胞總β—catenin的水平，接著我們將免疫共沉淀技術(shù)(IP)和western—blotting技術(shù)相結(jié)合，研究了姜黃素對細胞核內(nèi)β—catenin/Tcf—4復合物水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

6、，姜黃素可以降低核內(nèi)β—catenin/Tcf—4復合物的水平。此外，RT—PCR結(jié)果也表明，姜黃素處理能夠顯著降低β—catenin/Tcf—4的靶基因c—myc與cyclinD1 mRNA及蛋白質(zhì)的水平(P＜0.05)，這說明姜黃能夠下調(diào)β—catenin/Tcf—4的轉(zhuǎn)錄激活活性。用caspase—3的特異性小分子抑制劑Z—DEVD—FMK預處理HT—29細胞，則發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導的β—catenin斷裂被抑制；而β—catenin/

7、Tcf—4下游靶基因的表達則不受Z—DEVD—FMK處理的影響，這說明，姜黃素誘導的HT—29細胞內(nèi)β—catenin斷裂是由caspase—3介導的，姜黃素誘導的β—catenin/Tcf—4轉(zhuǎn)錄激活能力下降則與caspase—3無關(guān)。
　　 本論文運用RT—PCR及western—blotting技術(shù)進一步研究了β—catenin/Tcf—4轉(zhuǎn)錄激活的靶基因PPARδ、VEGF、COX—2、14—3—3ε等的表達情況，結(jié)果表

8、明，40—80μM的姜黃素處理可以顯著下調(diào)靶基因PPARδ mRNA及蛋白質(zhì)的水平(P＜0.05)，受PPARδ調(diào)節(jié)的基因14—3—3ε的表達水平也顯著下降(P＜0.05)，而14—3—3ε在細胞中可以與促凋亡蛋白Bad結(jié)合，從而抑制凋亡，姜黃素下調(diào)14—3—3ε的水平可能與Bad的水平升高有關(guān)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理可以顯著下調(diào)β—catenin/Tcf—4信號路徑VEGF和COX—2二個靶基因的水平，VEGF及COX—2均與結(jié)

9、腸癌細胞的增殖、分化及血管形成密切相關(guān)，這進一步說明了姜黃素可能通過下調(diào)β—catenin/Tcf—4信號途徑活性，來抑制結(jié)腸癌腫瘤細胞的生長與增殖。
　　 為了進一步研究姜黃素抑制HT—29細胞生長、增殖的分子機制，本論文研究了姜黃素的抗氧化及對HT—29細胞內(nèi)活性氧水平的影響。用化學體系進行的實驗證明，姜黃素可以猝滅DPPH、ABTS·+、O2·—、·OH等自由基，抑制亞油酸的過氧化反應(yīng)，保護pBR322質(zhì)粒DNA免受羥自由

10、基的氧化損傷。用10—80μM姜黃素處理HT—29細胞后，我們測定了細胞內(nèi)活性氧(ROS)及谷胱甘肽的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理可以顯著提高HT—29細胞內(nèi)活性氧的水平，并激活caspase—3，下調(diào)Bcl—2的表達水平，誘導HT—29細胞凋亡(P＜0.05)。為研究姜黃素誘導的caspase—3激活及細胞凋亡是否與其刺激的胞內(nèi)活性氧水平升高有關(guān)，本研究用抗氧化劑N—乙酰半胱氨酸(NAC)和過氧化氫酶(catalase)處理，以消除自由