APE1在線粒體DNA損傷修復(fù)中的作用及其線粒體定位機(jī)制的研究.pdf

1、氧化應(yīng)激與多種病理狀態(tài)密切相關(guān)，包括癌癥，衰老和心血管疾病等。DNA是氧化應(yīng)激損傷的重要靶分子之一，形成的DNA氧化性損傷主要經(jīng)堿基切除修復(fù)(BER)進(jìn)行修復(fù)。APE1為BER途徑的限速酶，其表達(dá)水平高低對于BER的活性至關(guān)重要。線粒體是除細(xì)胞核外唯一具有基因組DNA的細(xì)胞器，由于缺乏組蛋白，蛋白編碼區(qū)密集無內(nèi)含子，加之與電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈相鄰，mtDNA極易受到氧化應(yīng)激的損傷，有研究表明正常細(xì)胞mtDNA氧化損傷穩(wěn)態(tài)的水平是nDNA的3-15

2、倍。然而，正常細(xì)胞mtDNA修復(fù)活性較弱，通過基因治療的手段提高mtDNA修復(fù)能力成為增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激耐受性的新策略。通過外源性上調(diào)多種DNA糖基化酶的線粒體表達(dá)水平能有效增強(qiáng)mtDNA的修復(fù)活性從而提高哺乳動物細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的存活率。但是由于糖基化酶的底物特異性高，僅能針對單一損傷進(jìn)行修復(fù)，因此更多的研究集中在作用于BER共同通路的修復(fù)酶APE1，希望通過增強(qiáng)其活性達(dá)到更為廣泛的修復(fù)增強(qiáng)效應(yīng)。有研究在線粒體中成功過表達(dá)全長野生

3、型APE1基因或APE1的同源基因，但卻無顯著的細(xì)胞效應(yīng)或產(chǎn)生與預(yù)期截然相反的效應(yīng)。最近有研究報道線粒體型與全長型APE1相比缺乏N端序列卻具有比全長型APE1更強(qiáng)的DNA修復(fù)活性，然而對于APE1這種缺乏典型的MTS的細(xì)胞核編碼的基因，其進(jìn)入線粒體的機(jī)制仍未完全明了。因此本研究首先觀察在不同的氧化應(yīng)激刺激下不同細(xì)胞株中APE1的亞細(xì)胞分布的改變情況，討論其在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的生物學(xué)效應(yīng)，然后擬構(gòu)建N端截短型APE1基因的線粒體表達(dá)載體增

4、強(qiáng)其線粒體表達(dá)，探討其對血管內(nèi)皮細(xì)胞mtDNA修復(fù)能力的影響，并進(jìn)一步觀察其對細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下凋亡和增殖的影響效應(yīng)，最后對APE1的線粒體定位信號進(jìn)行研究，為以線粒體APE1為靶點(diǎn)的基因治療提供理論基礎(chǔ)及可行策略。 研究目的： 1.探討不同的處理因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下不同細(xì)胞中APE1的線粒體轉(zhuǎn)位情況及差異； 2.探討截短型APE1基因線粒體定位表達(dá)對人內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激后存活和增殖能力的影響； 3

5、.探討APE1線粒體定位信號存在的可能區(qū)域，為進(jìn)一步研究其線粒體定位機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容和方法： 1.氧化應(yīng)激對APE1亞細(xì)胞定位的影響：采用激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的APE1在氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)定位的變化，同時提取線粒體組分蛋白證實(shí)形態(tài)學(xué)觀察。分析氧化應(yīng)激對APE1亞細(xì)胞定位的影響及與不同細(xì)胞直接變化的差異，為進(jìn)一步以線粒體APE1為靶點(diǎn)的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 2.截短型APE1線粒體定位表達(dá)載體的

6、構(gòu)建及其生物學(xué)效應(yīng)：以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為載體，首先通過PCR得到MTS和ND_APE1序列，而后經(jīng)過SOE得到拼接的基因，與線性化pcDNA3.1(+)質(zhì)粒連接后構(gòu)建pcDNA-mtAPE1-HA，經(jīng)測序鑒定。采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pcDNA-mtAPE1-HA后的亞細(xì)胞定位；Westernblot和APE活性分析檢測其對HUVE細(xì)胞線粒體APE1水平和mtDNA修復(fù)能力的增強(qiáng)作用；利用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測氧

7、化應(yīng)激后的細(xì)胞存活和增殖能力，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并用Westernblot檢測細(xì)胞色素C的胞漿釋放。 3.APE1線粒體定位信號的研究：構(gòu)建C端帶有EGFP和HA標(biāo)簽的不同長度的截短型APE1融合蛋白，用激光共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)的分布情況推測其線粒體定位信號大致的分布區(qū)域。 研究結(jié)果： 1.氧化應(yīng)激對APE1亞細(xì)胞定位的影響：電離輻射后3小時內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞中APE1分布由照射前細(xì)胞核分布轉(zhuǎn)變?yōu)橐园麧{為主的分布，

8、3小時線粒體APE1增加超過30倍；H2O2處理后3小時內(nèi)血管內(nèi)皮HUVE細(xì)胞APE1僅少量轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體，3小時內(nèi)線粒體APE1水平增加不超過5倍。 2.截短型APE1線粒體定位表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)效應(yīng)：經(jīng)測序分析表明成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA-mtAPE1-HA和對照載體pcDNA-flAPE1-HA。轉(zhuǎn)染HUVE細(xì)胞發(fā)現(xiàn)pcDNA-mtAPE1-HA能顯著增加線粒體APE1水平，而pcDNA-flAPE1-HA則明

9、顯增加細(xì)胞核APE1水平，兩者均能輕度增加胞漿APE1水平。pcDNA-mtAPE1-HA轉(zhuǎn)染能明顯增加線粒體APE活性，而不增加胞核APE活性；pcDNA-flAPE1-HA則僅能輕度增加胞核APE活性，不增加線粒體APE活性。在不同濃度H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激后，pcDNA-mtAPE1-HA轉(zhuǎn)染能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活和增殖能力，同時降低細(xì)胞凋亡率，而pcDNA-flAPE1-HA與對照組無顯著差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，pcDNA-m

10、tAPE1-HA轉(zhuǎn)染可抑制H2O2處理后細(xì)胞色素C的胞漿釋放。 3.APE1線粒體定位信號的研究：帶有EGFP標(biāo)簽的載體pEGFP-(42-318)-APE1，pEGFP-(60-318)-APE1，pEGFP-(249-318)-APE1和pEGFP-(288-318)-APE1表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)非特異性全細(xì)胞彌散分布，而C端帶有HA標(biāo)簽的表達(dá)載體pEGFP-(42-318)-APE1-HA，pEGFP-(60-31

11、8)-APE1-HA和pEGFP-(249-318)-APE1-HA出現(xiàn)特異性線粒體定位而pEGFP-(288-318)-APE1-HA則為非特異性全細(xì)胞彌散分布，由于這種亞細(xì)胞分布形式差異發(fā)生于249-288位氨基酸殘基的缺失，因此推測為改區(qū)域可能存在線粒體定位信號。 結(jié)論： 1.在電離輻射處理后早期，骨肉瘤HOS細(xì)胞內(nèi)APE1分布由單純細(xì)胞核表達(dá)向胞漿為主表達(dá)轉(zhuǎn)變；而在H2O2處理后早期，血管內(nèi)皮HUVE細(xì)胞內(nèi)少量A

12、PE1由細(xì)胞核向線粒體轉(zhuǎn)位。氧化應(yīng)激后早期APE1線粒體轉(zhuǎn)位是普遍現(xiàn)象，但是其程度和速度與不同細(xì)胞株對不同的處理因素敏感性差異相關(guān)。 2.通過將線粒體定位序列融合于N端33氨基酸序列缺失的APE1序列并構(gòu)建真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮HUVE細(xì)胞中能顯著增強(qiáng)線粒體APE1水平，而全長APE1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染僅能增加細(xì)胞核APE1水平。 3.截短型APE1線粒體特異性過表達(dá)能顯著增加血管內(nèi)皮細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激后細(xì)胞

13、存活及其增殖能力，而全長APE1過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡無保護(hù)效應(yīng)。 4.截短型APE1線粒體過表達(dá)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激后細(xì)胞存活，是通過阻斷線粒體途徑細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。 5.APE1的線粒體定位序列可能存在于C端的249-288位氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)。 6.構(gòu)建帶有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的融合蛋白時，C端的較大的標(biāo)簽如EGFP很可能影響APE1的線粒體定位序列的暴露，從而干擾其線粒體定位；而小肽標(biāo)簽如HA則能較好的暴