Peutz-Jeghers綜合征中LKB1-STK11基因新突變及功能研究.pdf

1、背景和目的：
　　 Peutz-Jephers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)是以多發(fā)性錯構(gòu)瘤樣胃腸道息肉和皮膚粘膜色素沉著為主要臨床表現(xiàn)，并具有高度腫瘤易感性的常染色體顯性遺傳性疾病，其臨床發(fā)病率約為1/120000-1/8300之間[1]。抑癌基因LKB1(Liver Kinase B1)/STK11被公認(rèn)為PJS的主要致病基因。STK11基因突變導(dǎo)致的LKB1蛋白激酶失活可引起包括PJ綜合征的

2、多種疾病的發(fā)生。目前，在PJ綜合征和散發(fā)腫瘤中已經(jīng)檢測出200多種STK11基因突變。世界范圍內(nèi)，STK11新突變不斷有報道，這進(jìn)一步豐富了STK11基因的突變譜，為STK11基因型與表型關(guān)系的研究提供有利的平臺，也為患者遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及隨訪計劃等奠定基礎(chǔ)。LKB1/STK11作為一種抑癌基因，先前研究已發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞極性、染色質(zhì)重構(gòu)及能量代謝等方面對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起至關(guān)重要的作用。然而，LKB1

3、確切的致病機(jī)制錯綜復(fù)雜，至今未能完全闡明，而不同的STK11基因突變可能通過作用于細(xì)胞功能活動的不同環(huán)節(jié)導(dǎo)致疾病發(fā)生。因此，本課題擬歸納PJ綜合征患者臨床資料，并通過對患者及其家屬進(jìn)行LKB1/STK11基因胚系突變篩查以豐富PJS患者基因突變譜，為進(jìn)一步分析PJS基因型和臨床表型的關(guān)系奠定基礎(chǔ);同時構(gòu)建STK11基因新突變表達(dá)質(zhì)粒，研究其對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及其下游信號表達(dá)等的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證突變是否為該P(yáng)JS家系的致病性突變。

4、r>　　 材料和方法：
　　 1、主要材料
　　 DNA提取試劑盒，MLPA試劑盒，Hela、SW1116、DLD1、HT29、SW620、SW480、LOVO、colo205、HCT116細(xì)胞，Lipofectamine2000 Reagent,Trizol,RIPA Buffer，細(xì)胞凋亡試劑盒，CCK8 Reagent，LKB1，P-AMPK(Thr172)、P70S6K(Thr389),P-AKT(Ser473

5、),VEGF,PCNA,β-actin,GAPDH等抗體。
　　 2、方法
　　 1) STK11引物設(shè)計
　　 利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫查找STK11基因的全長編碼序列。參考文獻(xiàn)直接引用文獻(xiàn)引物序列及用Primer3.0自行設(shè)計擴(kuò)增STK11基因的引物，并摸索引物反應(yīng)條件。
　　 2) PJS患者STK11基因胚系突變檢測
　　 收集來自廣州市南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的來自9個家系的12個PJS患者及

6、其家屬的血液、息肉標(biāo)本，同時收集南方醫(yī)院體檢中心50位正常人血液作為正常對照組。提取PJS先證者血液基因組DNA，PCR擴(kuò)增后純化回收產(chǎn)物，通過DNA直接測序法檢測STK11基因的胚系突變，利用HGMD、NCBI數(shù)據(jù)庫在線BLAST比對進(jìn)行初步篩查后，突變者基因分別與其家系健康人及正常對照組DNA序列比較，并參考NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫，排除單核苷酸多態(tài)性可能。對于DNA直接測序法未能檢測出突變者，采用MLPA技術(shù)進(jìn)行基因大片段缺失或

7、重復(fù)檢測，利用GeneMarker(R)HID STR Human Identity Software分析結(jié)果。
　　 3) LKB1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　 空載體質(zhì)粒pGCMV-GFP-Vecor、野生型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突變型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R)由上海吉瑪公司構(gòu)建，經(jīng)過測序再次鑒定。
　　 4) LKB1在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)
　　 Hela、SW11

8、16、DLD1、HT29、SW620、SW480、LOVO、colo205、HCT116細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。分別用Trizol裂解，通過RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測細(xì)胞中LKB1 mRNA基本表達(dá)水平;利用RIPA buffer（已加蛋白酶抑制劑）裂解不同腫瘤細(xì)胞，用蛋白印跡法(Western Blo

9、t)檢測細(xì)胞中LKB1蛋白的基本表達(dá)水平。比較不同腫瘤細(xì)胞中LKB1表達(dá)，并選取表達(dá)水平較低或者不表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 5) LKB1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)胞后LKB1mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 Hela細(xì)胞常規(guī)傳代均勻鋪于十二孔板內(nèi)，待長至約70-80％，分別予pGCMV-GFP-Vector、pGCMV-GFP-LKB1(WT)和pGCMV-GFP-LKB1(G288R)質(zhì)粒通過Lipofe

10、ctamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4-6小時后換液，48小時后提取細(xì)胞總mRNA及總蛋白，檢測并比較LKB1在不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)的差異。
　　 6) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞、SW1116細(xì)胞后對細(xì)胞增殖活性的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)Hela、SW1116細(xì)胞，并用100ul RPIM1640完全培養(yǎng)基含5000個細(xì)胞/孔（Hela細(xì)胞）鋪于96孔板內(nèi)，次日分別轉(zhuǎn)染空載體

11、質(zhì)粒pGCMV-GFP-Vecor，野生型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突變型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R)，48小時后各加入10ul/孔CCK-8試劑檢測450nM波長下各孔細(xì)胞的吸光值，比較不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 7) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞后對細(xì)胞克隆形成能力的影響
　　 細(xì)胞鋪于12孔板內(nèi)，同上瞬時轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞后，消化各個轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，離心后重懸，計

12、數(shù)并每孔取4000個細(xì)胞分別溶于各1.5ml0.35％瓊脂混合液中，混勻后鋪于已凝固的0.5％軟瓊脂的6孔板內(nèi)，每組設(shè)3個復(fù)孔，待其凝固，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)兩周后，0.05％結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后鏡下觀察，計數(shù)并拍照。比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　 8) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)胞后對細(xì)胞凋亡的影響
　　 三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)胞48小時后，消化細(xì)胞，800 rp

13、m，離心5min，冷PBS洗兩次;1*Binding Buffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約1*106cells/ml;取100ul(1*105 cells)上述重懸液至5ml EP管中;加入5ul FITC AnnexinV和5ul PI溶液;溫柔搖勻細(xì)胞，25℃，避光，15min后加入400ul1*BindingBuffer混勻，行流式細(xì)胞檢測，并比較不同組細(xì)胞凋亡率的差異。
　　 9) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)

14、胞后對LKB1/AMPK/mTOR信號通路及對磷酸化蛋白P-AKT(Ser473)表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞鋪于12孔板內(nèi)，同上瞬時轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時并饑餓12小時后RIPA Buffer（已加蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，檢測并比較不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中LKB1/AMPK/mTOR信號通路蛋白、PCNA蛋白表達(dá);另外，不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時并饑餓12小時后，裂解前5min予胰島素(50nM)刺激細(xì)胞，檢測并比較不同

15、處理組P-AKT(Ser473)蛋白的表達(dá)水平。
　　 10)數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　 利用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，不同組結(jié)果利用one way ANOVA統(tǒng)計方法分析，方差齊者采用LSD、Bonferroni方法比較，方差不齊者則采用Dunnett T3方法為準(zhǔn)比較。采用“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（geometric means±standard deviation，M±S.D）”來表示數(shù)據(jù)，以P值＜0.05視為有顯著性差異。<

16、br>　　 結(jié)果：
　　 1、以正常人及家系健康人DNA作對照，來自9個家系的12例PJS患者中檢測出7種STK11基因突變，DNA直接測序法發(fā)現(xiàn)的突變包括3種點(diǎn)突變（錯義突變），1種單堿基插入，1種小片段缺失，MLPA技術(shù)檢測有2個家系分別發(fā)生STK11基因第1號和第3號外顯子的大片段缺失，均預(yù)測可能引起編碼蛋白表達(dá)或功能的異常。其中1例點(diǎn)突變?yōu)樾峦蛔儯丛诂F(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及既往文獻(xiàn)中報道;該新突變使STK11基因上第六號外顯子

17、的第862個位點(diǎn)由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致LKB1蛋白激酶活性區(qū)域的第288個氨基酸由GGG（G，甘氨酸）變?yōu)锳GG(R，精氨酸)。
　　 2、RT-PCR和western blot檢測Hela細(xì)胞與SW1116細(xì)胞中幾乎不表達(dá)LKB1mRNA及其蛋白，SW1116細(xì)胞的基因中未發(fā)現(xiàn)這種新突變。
　　 3、RT-PCR和western blot檢測Hela、SW1116細(xì)胞轉(zhuǎn)染LKB1質(zhì)粒后，與空白載體轉(zhuǎn)染組

18、相比，野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中LKB1mRNA和蛋白的水平明顯上調(diào)，且表達(dá)量相當(dāng)(P＞0.05)。
　　 4、對轉(zhuǎn)染LKB1質(zhì)粒的Hela及SW1116細(xì)胞進(jìn)行CCK8(Cell counting Kit8)檢測發(fā)現(xiàn)，與空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒細(xì)胞于450nm波長處吸光值(OD450)明顯降低(P＜0.01)，而空載體組與突變組之間OD450值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，即野生型

19、組細(xì)胞增殖活性降低。
　　 5、LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞后進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體組和突變型質(zhì)粒組的細(xì)胞克隆數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒組細(xì)胞克隆數(shù)量下降超過50％，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);而空載體組與突變組之間無明顯差異(P＞0.05)，即野生型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成能力明顯降低。
　　 6、流式細(xì)胞術(shù)檢測Hela細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，野生型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(Annexin V-FITC

20、陽性者即總凋亡率為20.78±2.32％; Annexin V-FITC陽性并PI陰性者即早期凋亡率為16.46±2.09％)與突變型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(20.30-2.87;16.67±2.21％)無明顯差異(P＞0.05)，而兩組細(xì)胞凋亡率較空白對照組(7.67±1.65％;4.43±0.60％)明顯升高(P＜0.01);同樣，SW1116細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，野生型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(Annexin V-FITC陽性者即總凋亡率

21、為21.70±2.07％;Annexin V-FITC陽性并PI陰性者即早期凋亡率為16.74±1.63％)與突變型轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(20.96±2.95％;15.62±1.93％)無明顯差異(P＞0.05)，而兩組細(xì)胞凋亡率較空白對照組(13.97±1.63％;9.46±1.15％)明顯升高(P＜0.01)。說明新突變可能不影響LKB1對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。
　　 7、與空載體和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒

22、的細(xì)胞中AMPK蛋白的Thr172位點(diǎn)磷酸化水平升高(P＜0.01)，其下游信號蛋白P70S6K于Thr389位點(diǎn)的磷酸化水平降低(P＜0.01)，而VEGF、PCNA、P-AKT(Ser473)蛋白表達(dá)水平則明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、LKB1/STK11基因胚系突變可導(dǎo)致PJ綜合征的發(fā)生，9個PJS家系中發(fā)現(xiàn)的7種突變均為致病性突變;PJS患者中的STK11突變c.862G＞A，即p.288G

23、＞R，為新發(fā)現(xiàn)的LKB1/STK11基因胚系突變;
　　 2、首次采用結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW1116進(jìn)行LKB1基因突變的功能研究，發(fā)現(xiàn)G288R對LKB1mRNA及蛋白量的表達(dá)無影響，提示該突變可能不影響LKB1基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程;
　　 3、G288R部分或全部失去LKB1抑制細(xì)胞增殖的能力，而對LKB1促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能無明顯影響;
　　 4、G288R失去磷酸化激活A(yù)MPK的能力，使下游mTOR異?；罨崾拘?/p>