Peutz-Jeghers綜合征中LKB1-STK11基因新突變及功能研究.pdf

1、背景和目的：
　　 Peutz-Jephers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)是以多發(fā)性錯構(gòu)瘤樣胃腸道息肉和皮膚粘膜色素沉著為主要臨床表現(xiàn)，并具有高度腫瘤易感性的常染色體顯性遺傳性疾病，其臨床發(fā)病率約為1/120000-1/8300之間[1]。抑癌基因LKB1(Liver Kinase B1)/STK11被公認為PJS的主要致病基因。STK11基因突變導致的LKB1蛋白激酶失活可引起包括PJ綜合征的

2、多種疾病的發(fā)生。目前，在PJ綜合征和散發(fā)腫瘤中已經(jīng)檢測出200多種STK11基因突變。世界范圍內(nèi)，STK11新突變不斷有報道，這進一步豐富了STK11基因的突變譜，為STK11基因型與表型關系的研究提供有利的平臺，也為患者遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及隨訪計劃等奠定基礎。LKB1/STK11作為一種抑癌基因，先前研究已發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)控細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞極性、染色質(zhì)重構(gòu)及能量代謝等方面對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起至關重要的作用。然而，LKB1

3、確切的致病機制錯綜復雜，至今未能完全闡明，而不同的STK11基因突變可能通過作用于細胞功能活動的不同環(huán)節(jié)導致疾病發(fā)生。因此，本課題擬歸納PJ綜合征患者臨床資料，并通過對患者及其家屬進行LKB1/STK11基因胚系突變篩查以豐富PJS患者基因突變譜，為進一步分析PJS基因型和臨床表型的關系奠定基礎;同時構(gòu)建STK11基因新突變表達質(zhì)粒，研究其對細胞增殖、細胞凋亡及其下游信號表達等的影響，并進一步驗證突變是否為該PJS家系的致病性突變。

4、r>　　 材料和方法：
　　 1、主要材料
　　 DNA提取試劑盒，MLPA試劑盒，Hela、SW1116、DLD1、HT29、SW620、SW480、LOVO、colo205、HCT116細胞，Lipofectamine2000 Reagent,Trizol,RIPA Buffer，細胞凋亡試劑盒，CCK8 Reagent，LKB1，P-AMPK(Thr172)、P70S6K(Thr389),P-AKT(Ser473

5、),VEGF,PCNA,β-actin,GAPDH等抗體。
　　 2、方法
　　 1) STK11引物設計
　　 利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫查找STK11基因的全長編碼序列。參考文獻直接引用文獻引物序列及用Primer3.0自行設計擴增STK11基因的引物，并摸索引物反應條件。
　　 2) PJS患者STK11基因胚系突變檢測
　　 收集來自廣州市南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院的來自9個家系的12個PJS患者及

6、其家屬的血液、息肉標本，同時收集南方醫(yī)院體檢中心50位正常人血液作為正常對照組。提取PJS先證者血液基因組DNA，PCR擴增后純化回收產(chǎn)物，通過DNA直接測序法檢測STK11基因的胚系突變，利用HGMD、NCBI數(shù)據(jù)庫在線BLAST比對進行初步篩查后，突變者基因分別與其家系健康人及正常對照組DNA序列比較，并參考NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫，排除單核苷酸多態(tài)性可能。對于DNA直接測序法未能檢測出突變者，采用MLPA技術進行基因大片段缺失或

7、重復檢測，利用GeneMarker(R)HID STR Human Identity Software分析結(jié)果。
　　 3) LKB1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　 空載體質(zhì)粒pGCMV-GFP-Vecor、野生型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突變型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R)由上海吉瑪公司構(gòu)建，經(jīng)過測序再次鑒定。
　　 4) LKB1在不同腫瘤細胞中的表達
　　 Hela、SW11

8、16、DLD1、HT29、SW620、SW480、LOVO、colo205、HCT116細胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。分別用Trizol裂解，通過RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應)檢測細胞中LKB1 mRNA基本表達水平;利用RIPA buffer（已加蛋白酶抑制劑）裂解不同腫瘤細胞，用蛋白印跡法(Western Blo

9、t)檢測細胞中LKB1蛋白的基本表達水平。比較不同腫瘤細胞中LKB1表達，并選取表達水平較低或者不表達的細胞株進行后續(xù)實驗。
　　 5) LKB1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細胞后LKB1mRNA和蛋白的表達
　　 Hela細胞常規(guī)傳代均勻鋪于十二孔板內(nèi)，待長至約70-80％，分別予pGCMV-GFP-Vector、pGCMV-GFP-LKB1(WT)和pGCMV-GFP-LKB1(G288R)質(zhì)粒通過Lipofe

10、ctamine2000脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細胞，轉(zhuǎn)染4-6小時后換液，48小時后提取細胞總mRNA及總蛋白，檢測并比較LKB1在不同轉(zhuǎn)染組細胞中mRNA和蛋白表達的差異。
　　 6) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞、SW1116細胞后對細胞增殖活性的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)Hela、SW1116細胞，并用100ul RPIM1640完全培養(yǎng)基含5000個細胞/孔（Hela細胞）鋪于96孔板內(nèi)，次日分別轉(zhuǎn)染空載體

11、質(zhì)粒pGCMV-GFP-Vecor，野生型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突變型質(zhì)粒pGCMV-GFP-LKB1(G288R)，48小時后各加入10ul/孔CCK-8試劑檢測450nM波長下各孔細胞的吸光值，比較不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對細胞增殖活性的影響。
　　 7) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞后對細胞克隆形成能力的影響
　　 細胞鋪于12孔板內(nèi)，同上瞬時轉(zhuǎn)染SW1116細胞后，消化各個轉(zhuǎn)染組細胞，離心后重懸，計

12、數(shù)并每孔取4000個細胞分別溶于各1.5ml0.35％瓊脂混合液中，混勻后鋪于已凝固的0.5％軟瓊脂的6孔板內(nèi)，每組設3個復孔，待其凝固，37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)兩周后，0.05％結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后鏡下觀察，計數(shù)并拍照。比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對細胞克隆形成能力的影響。
　　 8) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細胞后對細胞凋亡的影響
　　 三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細胞48小時后，消化細胞，800 rp

13、m，離心5min，冷PBS洗兩次;1*Binding Buffer重懸細胞，使細胞濃度約1*106cells/ml;取100ul(1*105 cells)上述重懸液至5ml EP管中;加入5ul FITC AnnexinV和5ul PI溶液;溫柔搖勻細胞，25℃，避光，15min后加入400ul1*BindingBuffer混勻，行流式細胞檢測，并比較不同組細胞凋亡率的差異。
　　 9) LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細

14、胞后對LKB1/AMPK/mTOR信號通路及對磷酸化蛋白P-AKT(Ser473)表達的影響
　　 細胞鋪于12孔板內(nèi)，同上瞬時轉(zhuǎn)染Hela、SW1116細胞，轉(zhuǎn)染48小時并饑餓12小時后RIPA Buffer（已加蛋白酶抑制劑）裂解細胞，檢測并比較不同轉(zhuǎn)染組細胞中LKB1/AMPK/mTOR信號通路蛋白、PCNA蛋白表達;另外，不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48小時并饑餓12小時后，裂解前5min予胰島素(50nM)刺激細胞，檢測并比較不同

15、處理組P-AKT(Ser473)蛋白的表達水平。
　　 10)數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　 利用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，不同組結(jié)果利用one way ANOVA統(tǒng)計方法分析，方差齊者采用LSD、Bonferroni方法比較，方差不齊者則采用Dunnett T3方法為準比較。采用“算術平均值±標準差（geometric means±standard deviation，M±S.D）”來表示數(shù)據(jù)，以P值＜0.05視為有顯著性差異。<

16、br>　　 結(jié)果：
　　 1、以正常人及家系健康人DNA作對照，來自9個家系的12例PJS患者中檢測出7種STK11基因突變，DNA直接測序法發(fā)現(xiàn)的突變包括3種點突變（錯義突變），1種單堿基插入，1種小片段缺失，MLPA技術檢測有2個家系分別發(fā)生STK11基因第1號和第3號外顯子的大片段缺失，均預測可能引起編碼蛋白表達或功能的異常。其中1例點突變?yōu)樾峦蛔?，未曾在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及既往文獻中報道;該新突變使STK11基因上第六號外顯子

17、的第862個位點由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，導致LKB1蛋白激酶活性區(qū)域的第288個氨基酸由GGG（G，甘氨酸）變?yōu)锳GG(R，精氨酸)。
　　 2、RT-PCR和western blot檢測Hela細胞與SW1116細胞中幾乎不表達LKB1mRNA及其蛋白，SW1116細胞的基因中未發(fā)現(xiàn)這種新突變。
　　 3、RT-PCR和western blot檢測Hela、SW1116細胞轉(zhuǎn)染LKB1質(zhì)粒后，與空白載體轉(zhuǎn)染組

18、相比，野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中LKB1mRNA和蛋白的水平明顯上調(diào)，且表達量相當(P＞0.05)。
　　 4、對轉(zhuǎn)染LKB1質(zhì)粒的Hela及SW1116細胞進行CCK8(Cell counting Kit8)檢測發(fā)現(xiàn)，與空載體轉(zhuǎn)染組細胞和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒細胞于450nm波長處吸光值(OD450)明顯降低(P＜0.01)，而空載體組與突變組之間OD450值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，即野生型

19、組細胞增殖活性降低。
　　 5、LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞后進行軟瓊脂克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體組和突變型質(zhì)粒組的細胞克隆數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒組細胞克隆數(shù)量下降超過50％，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);而空載體組與突變組之間無明顯差異(P＞0.05)，即野生型轉(zhuǎn)染組細胞克隆形成能力明顯降低。
　　 6、流式細胞術檢測Hela細胞的細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，野生型轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率(Annexin V-FITC

20、陽性者即總凋亡率為20.78±2.32％; Annexin V-FITC陽性并PI陰性者即早期凋亡率為16.46±2.09％)與突變型轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率(20.30-2.87;16.67±2.21％)無明顯差異(P＞0.05)，而兩組細胞凋亡率較空白對照組(7.67±1.65％;4.43±0.60％)明顯升高(P＜0.01);同樣，SW1116細胞進行流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，野生型轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率(Annexin V-FITC陽性者即總凋亡率

21、為21.70±2.07％;Annexin V-FITC陽性并PI陰性者即早期凋亡率為16.74±1.63％)與突變型轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率(20.96±2.95％;15.62±1.93％)無明顯差異(P＞0.05)，而兩組細胞凋亡率較空白對照組(13.97±1.63％;9.46±1.15％)明顯升高(P＜0.01)。說明新突變可能不影響LKB1對細胞凋亡的促進作用。
　　 7、與空載體和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞相比，轉(zhuǎn)染野生型LKB1質(zhì)粒

22、的細胞中AMPK蛋白的Thr172位點磷酸化水平升高(P＜0.01)，其下游信號蛋白P70S6K于Thr389位點的磷酸化水平降低(P＜0.01)，而VEGF、PCNA、P-AKT(Ser473)蛋白表達水平則明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、LKB1/STK11基因胚系突變可導致PJ綜合征的發(fā)生，9個PJS家系中發(fā)現(xiàn)的7種突變均為致病性突變;PJS患者中的STK11突變c.862G＞A，即p.288G

23、＞R，為新發(fā)現(xiàn)的LKB1/STK11基因胚系突變;
　　 2、首次采用結(jié)腸腺癌細胞SW1116進行LKB1基因突變的功能研究，發(fā)現(xiàn)G288R對LKB1mRNA及蛋白量的表達無影響，提示該突變可能不影響LKB1基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程;
　　 3、G288R部分或全部失去LKB1抑制細胞增殖的能力，而對LKB1促進細胞凋亡可能無明顯影響;
　　 4、G288R失去磷酸化激活AMPK的能力，使下游mTOR異?；罨崾拘?/p>