中國Peutz-Jeghers綜合征患者STK11-LKB1基因突變篩查及PJ息肉蛋白質組學分析.pdf

1、背景/目的:
　　 Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers Syndrome，PJS，MIM#175200)是一種以皮膚粘膜黑斑、胃腸道多發(fā)息肉為特征的罕見常染色體顯性遺傳病。胃腸道多發(fā)息肉在患者青少年時期常常引起腸套疊、腸梗阻、消化道出血;隨著年齡增長，PJS患者不僅消化道息肉有惡變潛能，還可伴發(fā)生殖系統(tǒng)和其他許多器官的良性或惡性腫瘤，其家族的癌癥發(fā)病率也較普通人群為高。目前尚無干預措施能根治和預防PJS

2、發(fā)病及息肉惡變。因此，研究PJS相關致病基因、息肉發(fā)生及惡變的途徑和機制具有非常重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　 PJS致病基因STK11/LKB1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一個抑癌作用的蛋白激酶，其屬于AMPKK家族成員，通過對AMPK的變構調(diào)節(jié)，實現(xiàn)對能量代謝的調(diào)控;還可能通過轉錄因子SPI對VEGF產(chǎn)生負向調(diào)控，抑制細胞的增殖，也可能通過調(diào)控細胞周期，使細胞周期停滯G1期、促進細胞凋亡，抑制細胞增殖;在誘

3、導神經(jīng)細胞極性的形成中，通過與STRAD蛋白形成復合物而活化后，KB1S431A過量表達（一種絲氨酸-丙氨酸突變），抑制軸分化;另有報道，STK11基因在非小細胞肺癌的極性調(diào)控中，可能通過JNK信號通路，對轉錄因子AP-1、c-Jun、JunD和ATF2進行調(diào)控，提高轉錄活性參與細胞極性形成。然而，關于PJS息肉形成及惡變機制的研究仍處于初級階段。
　　 近年來，有報道PJ息肉為腺瘤樣息肉，可發(fā)生癌變;另有報道錯構瘤本身也可能演

4、變?yōu)橄倭龊桶?，即存在著由錯構瘤→腺瘤→腺癌的演變過程;還有學者認為有兩種機理導致PJS患者惡變，即錯鉤瘤→腺瘤→腺癌途徑和de nove的惡變途徑。然而，PJS錯構瘤性息肉發(fā)生不典型增生/腺瘤樣變的頻率較低，因此，研究PJS息肉惡變的途徑和機制一直是該領域的瓶頸。
　　 隨著對PJS疾病的深入研究，探討STK11/LKB1基因的突變類型、突變位點與PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的關系，已成為該領域基礎研究和臨床研究的焦點。Lim W等報

5、道PJS患者STK11/LKB1基因第三號外顯子突變，發(fā)生惡性腫瘤風險高;Mehenni H則認為該基因第六號外顯子突變與惡性腫瘤相關;Schumacher發(fā)現(xiàn)其羧基端和VIB-Ⅷ功能區(qū)的錯義突變與惡性腫瘤的關聯(lián)更為密切，而移碼缺失與剪切位點突變被認為與惡性腫瘤的發(fā)生無關，乳腺癌的發(fā)生主要由截短突變引起。然而，這些發(fā)現(xiàn)并沒有被其他獨立的PJS人群所證實。
　　 目前，PJS致病基因STK11/LKB1在不同研究人群中顯示出較大差

6、異的突變率(50％-90％)，基因型和表型的關系尚無定論，且PJS患者息肉惡變風險、惡變途徑尚存爭議。這些群體間的差異，不僅由于潛在的群體遺傳學分層，樣本量偏小也是重要原因，導致研究結果存在一定程度的分歧、無法在大規(guī)模人群中重復?？梢?，增加標本量，建立PJS家系生物標本庫，做好隨訪工作，是進行這一罕見遺傳病研究迫切需要解決的問題。
　　 本課題探討建立PJS家系生物標本庫的標準化程序，研究并制定規(guī)范化的組織及血液樣品等生物標本采

7、集、處理、保存操作流程，建立功能完善、信息豐富的PJS家系生物標本庫。在此基礎上，對PJS患者進行臨床病理特征分析，探討PJ息肉的病理演變過程，評估中國PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的風險;并進行分子遺傳學分析，繪制STK11/LKB1基因突變圖譜，尋找中國PJS患者STK11/LKB1基因可能存在的突變熱點區(qū)域及基因型和表型的關系;應用ProteinPathway Array技術進行PJ息肉蛋白質組學分析，識別與PJ息肉發(fā)生發(fā)展可能相關的信號

8、傳導通路蛋白以及潛在的分子治療靶點。
　　 方法:
　　 1、借鑒國內(nèi)外標本庫建立的標準化程序，收集全國范圍內(nèi)PJS患者及家系正常人的血液標本和息肉組織標本，采用收集-反饋-修改的模式對標本收集的操作流程不斷完善，并健全各種管理和質量控制措施。
　　 2、分析61個中國PJS家系133例PJS患者的臨床病理資料，探討PJ息肉的病理演變過程，評估中國PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的風險。
　　 3、聯(lián)合應用Sang

9、er測序和MLPA檢測技術，對52個PJS家系（遺傳性家系25個，散發(fā)性家系27個）共計116例PJS患者、95例PJS家系正常人，進行STK11/LKB1基因突變篩查，并分析基因型和表型的關系。
　　 4、選取明確STK11/LKB1基因突變檢測結果的28例PJS新鮮息肉組織和35例結腸癌癌旁正常組織（無STK11/LKB1基因突變），應用Protein PathwayArray技術篩選與PJ息肉相關的蛋白表達譜，并用West

10、ern Blot和IHC予以鑒定。
　　 5、統(tǒng)計方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件包，計數(shù)資料分別計算例數(shù)和所占比例，構成情況間的差別用x2檢驗或Fisher's精確檢驗，應用Student's t-test和Significant Analysis of Microarray(SAM)進行差異蛋白質的篩選。以P＜0.05，Q＜5為有統(tǒng)計學差異。
　　 結果:
　　 1、初步建立中國PJS家系生物標本庫通過

11、制定標準化的標本收集流程，我們收集了61個PJS家系(28個遺傳性家系和33個散發(fā)性家系)，133例PJS患者以及95例家系正常成員的生物標本，包括全血、血清、新鮮息肉組織、息肉蠟塊組織以及正常粘膜組織，采集了完整的臨床病理資料，并記錄長期跟蹤隨訪信息（尤其是息肉切除、息肉病理及惡性腫瘤發(fā)生的信息），初步建立了PJS家系生物標本庫。定期隨機抽取樣本提取DNA和蛋白進行檢測，證明所收集的標本具有較高質量。
　　 2、中國PJS患者

12、臨床病理特征的分析分析133例PJS患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)85例(64％，85/133)患者經(jīng)歷過至少一次外科剖腹手術（1-5次），第一次手術的平均年齡為17.29歲(3-68歲），多發(fā)息肉或體積較大息肉引起的小腸套疊或腸梗阻是導致外科手術的主要原因。16例(12％，16/133)患者的息肉出現(xiàn)錯構瘤伴輕/中度不典型增生，患者平均年齡30.4歲，息肉直徑均在3厘米以上，2枚息肉位于胃底，9枚分布于小腸，1枚位于直腸，其余息肉分布于結腸

13、。25例PJS患者(18.8％，25/133)合并了27例惡性腫瘤，消化道腫瘤占66.7％(18/27)，其次為乳腺癌和婦科腫瘤，占25.9％(7/27)，另有白血病和肺癌各一例;其中2例PJS患者分別合并兩種不同的惡性腫瘤，一例合并小腸癌、宮頸癌，另一例合并小腸癌、乳腺癌;患者發(fā)生惡性腫瘤的平均年齡為37.4歲（27-68歲）。
　　 3、Sanger測序法檢測STK11/LKB1基因突變應用Sanger測序對52個PJS家系

14、進行STK11/LKB1基因的突變篩查，27例先證者(51.9％，27/52)中檢測到25種不同的STK11/LKB1基因突變，包括8個錯義突變和17個截短突變，突變均與家系表型共分離，且在50例正常對照中未發(fā)現(xiàn)相同突變;其中，10種突變(40％，10/25)與PJS患者合并惡性腫瘤相關，包括胃腸道惡性腫瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌及白血病;14種(56％，14/25)突變?yōu)槭状螆蟮赖男碌牟±硇酝蛔?，包括四個缺失突變(c.151-16

15、2de112，c.308_317del10，c.834_835delTG, c.898-906de19)、三個插入突變(c.402-403dupTG,c.892-893insC，c.402-403dupTG)、兩個無義突變(c.783 C＞G, c.904 C＞T)、兩個剪切位點突變(IVS2-1 G＞A，IVS5+2 T＞C)以及三個錯義突變(c.862 G＞A,c.866T＞G, c.891 G＞C)。值得注意的是，8個突變(8/2

16、7，29.6％)位于STK11/LKB1基因第七號外顯子，是STK11/LKB1基因九個外顯子中最短的一個，僅編碼19個氨基酸，疑似中國PJS患者的突變熱點。
　　 4、MLPA技術檢測STK11/LKB1基因大片段缺失/重復應用MLPA技術檢測25例Sanger測序未發(fā)現(xiàn)STK11/LKB1基因突變的PJS先證者，發(fā)現(xiàn)8例(15.4％，8/25)先證者存在該基因的大片段缺失，其中4例為1號外顯子缺失(c.-1114-?_290

17、+?del)，1例為3號外顯子缺失(c.375-?_464+?del)，1例為3-9號外顯子缺失(c.375-?_1365+? del)，1例為4-6號外顯子缺失(c.465-?_862+?del)，1例為6號外顯子缺失(c.735-?_862+?del);三個PJS家系合并惡性腫瘤的發(fā)生，包括結腸癌、胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌。
　　 5、分析基因型和表型的關系遺傳性PJS家系STK11/LKB1基因突變率為80％(20/25)，

18、高于散發(fā)性家系的突變率55.6％(15/27)(p=0.06);在116例PJS患者中，18例(21.7％，18/83)攜帶STK11/LKB1基因突變的患者發(fā)生惡性腫瘤，5例(15.2％，5/33)未攜帶基因突變的患者合并惡性腫瘤(p=0.462);此外，5個插入突變和3個(3/4)無義突變所在的8個PJS家系中均合并了惡性腫瘤的發(fā)生，而所有剪切位點突變（5個）和小片段缺失突變（4個）所在的家系中未合并惡性腫瘤。
　　 6、S

19、TK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與PJ息肉發(fā)生不典型增生相關將檢測出的27個STK11/LKB1基因突變位點按照STK11蛋白不同的功能區(qū)(Ⅰ-Ⅺ)進行分組，發(fā)現(xiàn)10個(37％，10/27)突變位于STK11蛋白第Ⅺ功能區(qū)(277-309氨基酸殘基)，其中9個(90％，9/10)突變與胃腸道錯構瘤性息肉發(fā)生不典型增生相關，且攜帶不典型增生息肉的患者平均年齡26.8歲（16-44歲）;然而，在STK11蛋白第Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)的17個基因突

20、變中，僅有2個(11.8％，2/17)突變與PJ息肉發(fā)生不典型增生相關;兩組相比較，有顯著性差異(p=0.0001)。隨后，回顧性分析了HGMD數(shù)據(jù)庫中PJS患者STK11/LKB1基因突變與惡性腫瘤的關系，發(fā)現(xiàn)76.9％(10/13)的Ⅺ功能區(qū)突變與惡性腫瘤相關。
　　 7、p-p38MAPK蛋白在STK11/LKB1基因Ⅺ功能區(qū)突變的PJ息肉中表達顯著升高為進一步探討STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與惡性腫瘤相關的機制

21、，應用Protein Pathway Array技術對PJ息肉組織和正常腸粘膜組織進行蛋白質組學分析，比較13例攜帶STK11/LKB1基因Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)突變的PJ息肉與4例Ⅺ功能區(qū)突變的PJ息肉中蛋白表達的差異，發(fā)現(xiàn)Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)突變的PJS息肉中p-p38MAPK蛋白表達高于正常腸粘膜1.83倍，而Ⅺ功能區(qū)突變的息肉中該蛋白表達高于正常腸粘膜3.23倍，兩組比較，p-p38MAPK蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.003)，并用Wes

22、tern Blot驗證了該結果。
　　 8、Galectin-3蛋白可能成為抑制PJ息肉生長的分子治療靶點除p-p38MAPK蛋白外，應用Protein Pathway Array技術對28例PJS息肉組織和35例正常腸粘膜組織進行蛋白表達的篩選中還發(fā)現(xiàn)39種差異蛋白，13種蛋白在PJ息肉組織中呈高表達，26種蛋白呈低表達，并用Western Blot和IHC驗證了Galectin-3，GSTP1，NQO1，COX-2及ICAM

23、-1蛋白的表達，肯定了Proteinpathway array實驗結果的可靠性。其中，Galectin-3（半乳糖凝集素-3）蛋白在PJ息肉中的表達是正常粘膜的7倍，在PJS錯構瘤和發(fā)生不典型增生的息肉中均呈胞漿強陽性表達，且其抑制劑低分子柑橘果膠(MCP)毒副作用極小，故該蛋白有望成為抑制PJ息肉生長的分子治療靶點。
　　 9、應用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數(shù)據(jù)分析平臺預測PJ息肉發(fā)生機制綜

24、合PJ息肉中篩選出的差異蛋白，我們分析STK11/LKB1基因突變后可能激活p38MAPK蛋白，從而通過調(diào)節(jié)炎癥反應（COX-2，ICAM-1）和代謝途徑（Galectin-3，GSTP1，NQO1）引起PJ息肉的形成，且p-p38MAPK蛋白可能在STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變息肉發(fā)生不典型增生的病理演變過程中發(fā)揮重要作用。
　　 結論:
　　 1、規(guī)范化操作流程的建立有利于提高PJS家系生物標本收集的效率、提

25、高標本庫質量（包括生物樣本和系統(tǒng)臨床隨訪資料），具有創(chuàng)新性和較強可操作性。
　　 2、首次報道中國PJS患者STK11/LKB1基因突變率，達67.3％，繪制了中國PJS患者STK11/LKB1基因突變圖譜，且第七號外顯子可能是中國PJS患者的突變熱點，并發(fā)現(xiàn)14種新的致病突變。
　　 3、提出一種新的基因型和表型的關系，即STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與PJS患者錯構瘤性息肉發(fā)生不典型增生相關;并發(fā)現(xiàn)p-p38

26、MAPK蛋白可能在這一病理演變過程中發(fā)揮重要作用。
　　 4、發(fā)現(xiàn)Galectin-3蛋白可能成為抑制PJ息肉生長的潛在治療靶點，其天然抑制劑低分子柑橘果膠(MCP)有望應用于PJS患者臨床治療。
　　 5、中國PJS患者因腸梗阻/腸套疊首次行剖腹手術(64％)、PJ息肉出現(xiàn)錯構瘤伴輕/中度不典型增生(12％)以及PJS患者合并惡性腫瘤(19％)的年齡均較輕，平均年齡分別為17.29歲、30.4歲和37.4歲，為制定良好