FoxO1對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎病(Diabetes nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因。DN早期的基本病理改變包括系膜細(xì)胞（Mesangial cells，MCs）過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)聚積和基底膜增厚，最終可導(dǎo)致糖尿病性腎小球硬化癥，尤其MCs的過度增殖在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用。國(guó)內(nèi)外研究表明，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1)作為體內(nèi)眾多重要信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，磷脂酰

2、肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通過其核-質(zhì)穿梭調(diào)控，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，在糖脂代謝、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)控細(xì)胞增殖/凋亡，腫瘤發(fā)生等中的發(fā)揮重要作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在DN大鼠動(dòng)物模型的腎皮質(zhì)及高濃度葡萄糖培養(yǎng)的RMCs中FoxO1活性水平均降低，表明FoxO1活性水平降低與DN早期系膜細(xì)胞過度增殖可能存在相關(guān)性。本研究擬在細(xì)胞學(xué)水平，通過構(gòu)建組成性激活突變型FoxO1過表達(dá)慢病毒載體，靶向性上

3、調(diào)MCs內(nèi)活性FoxO1的表達(dá)，進(jìn)一步觀察FoxO1對(duì)MCs增殖的影響并對(duì)其下游機(jī)制進(jìn)行探討。
　　目的：
　　觀察慢病毒載體介導(dǎo)的組成性激活突變型(constitutively active，CA)FoxO1過表達(dá)對(duì)高糖培養(yǎng)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞（ratmesangial cells，RMCs）增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　通過四質(zhì)粒合成法構(gòu)建含組成性激活突變型FoxO1編碼序列的過表達(dá)慢病毒載

4、體(LV-CA-FoxO1)，并測(cè)定其病毒滴度及慢病毒載體感染RMCs的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。實(shí)驗(yàn)分為四組:以正常濃度(5.6mmol/L)葡萄糖培養(yǎng)的RMCs為對(duì)照組（NG組），將高濃度(25mmol/L)葡萄糖培養(yǎng)的RMCs分為三組:單純高糖組（HG0組）、高糖+空慢病毒載體組（HG1組）、高糖+LV-CA-FoxO1組（HG2組）。各組RMCs做不同處理72h后，實(shí)時(shí)熒光定量P

5、CR(qRT-PCR)分析FoxO1、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑（p27Kip1）及生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘生蛋白(Gadd45α)的mRNA相對(duì)表達(dá)量;蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)FoxO1、p-FoxO1蛋白水平;MTT比色法測(cè)定RMCs增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組RMCs細(xì)胞周期分布。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建含組成性激活突變型FoxO1編碼序列的過表達(dá)慢病毒載體LV-CA-FoxO1，并測(cè)得其滴度為1×108TU/mL及最佳M

6、OI為100。
　　2.與NG組相比，HG0組p27Kip1mRNA降低、p-FoxO1蛋白升高(t=10.92、10.13，均P＜0.05);
　　3.與HG1組相比，HG2組FoxO1、p27Kip1及Gadd45α的mRNA均升高（t=439.1、130.9、266.6，均P＜0.05），F(xiàn)oxO1及p-FoxO1也均升高(t=45.91、14.71，均P＜0.05);
　　4.與NG組相比，HG0組RMCs增殖

7、速率加快(t=30.28，P＜0.05);與HG1組相比，HG2組RMCs增殖速率受到明顯抑制(t=54.31，P＜0.05);
　　5.與HG1組相比，HG2組RMCs的細(xì)胞周期阻滯于G1期(t=14.51，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高濃度葡萄糖培養(yǎng)下RMCs內(nèi)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性水平下降，RMCs增殖速率加快。
　　2.過表達(dá)的活性FoxO1能抑制高濃度葡萄糖培養(yǎng)RMCs快速增殖，并使細(xì)胞周期阻滯于