基于調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的補(bǔ)肺益腎方“譜-效”相關(guān)性研究.pdf

1、　　補(bǔ)肺益腎方由人參、淫羊藿、赤芍、陳皮、枸杞子等十二味中藥組成,具有補(bǔ)益肺腎、納氣平喘、化痰止咳的功效,是中醫(yī)治療慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)穩(wěn)定期肺腎氣虛證的有效藥物,可減輕炎癥反應(yīng)和粘液分泌,減少對氣道壁的損傷,減輕氣道阻塞,從而降低對肺組織的損傷,延緩肺功能的下降。中藥指紋圖譜-藥效學(xué)(譜-效)相關(guān)性研究是將中藥指紋圖譜中標(biāo)示活性成分的特征峰數(shù)據(jù)與藥效結(jié)

2、果對應(yīng)起來,將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與中藥藥效聯(lián)系起來的研究方法,是開展中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要模式。因此,開展補(bǔ)肺益腎方的譜-效相關(guān)性研究,是揭示該復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并明確其作用機(jī)制的有效途徑。
　　目的：
　　以補(bǔ)肺益腎方為研究對象,優(yōu)選該方藥的提取工藝；建立補(bǔ)肺益腎方全方、拆方的HPLC指紋圖譜；分別以香煙煙霧提取物(Colombo Stock Exchange,CSE)和脂多糖(Lip Polysacc

3、haride,LPS)刺激肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞為研究模型,進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),闡釋補(bǔ)肺益腎方及其拆方調(diào)控A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)及其特征；對得到的指紋圖譜特征峰信息和藥效指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算,闡明指紋圖譜數(shù)據(jù)與藥效特證信息的相關(guān)性,為揭示補(bǔ)肺益腎方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：
　　1 對補(bǔ)肺益腎方中人參、枸杞子等藥材用水提醇沉法提取,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以人參皂苷Rg1、Re、Rb1

4、的總含量為指標(biāo),考察加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)及醇沉濃度對提取工藝的影響；對方中淫羊藿、赤芍等藥材用乙醇回流提取,采用L9(34)正交試驗(yàn)法,以淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷含量為指標(biāo),考察乙醇濃度、乙醇用量、回流時(shí)間和回流次數(shù)對醇提工藝的影響,優(yōu)化提取條件。
　　2 對補(bǔ)肺益腎方進(jìn)行拆方,通過篩選高效液相色譜條件,根據(jù)化學(xué)指紋圖譜研究的要求,運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件,建立補(bǔ)肺益腎方及其拆方的HPLC指紋圖譜,并對各色

5、譜峰進(jìn)行歸屬,找出藥材來源及所代表的化學(xué)成分。
　　3 分別以 CSE 和 LPS 刺激 A549 細(xì)胞,MTT 法篩選出最佳的刺激濃度后, A549細(xì)胞按孔平均分為正常組(20%正常大鼠血清)、刺激組(20%正常大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)、用藥組(20%補(bǔ)肺益腎各拆方組大鼠血清+75 pg/mL LPS或5%CSE)安排實(shí)驗(yàn),用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immuno Sorbent

6、Assay,ELISA)法檢測A549細(xì)胞對粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-3、IL-8、IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 及其抑制物-1 (MMP-9 和 TIMP-1)、酶磷脂酸脂肪酶 2B (PPAP2B)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(CD36)、超氧化物歧化酶(SOD)的分泌及變化情況。
　　4 采用雙變量相關(guān)分析方法,將補(bǔ)肺益腎方各拆方組HP

7、LC指紋圖譜的峰面積進(jìn)行量化,與ELISA法測得的各拆方組血清干預(yù)A549細(xì)胞炎癥因子的結(jié)果相結(jié)合,計(jì)算pearson相關(guān)系數(shù),并對相關(guān)性進(jìn)行分析,構(gòu)建補(bǔ)肺益腎方“化學(xué)譜”–“藥效”關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1 補(bǔ)肺益腎方最佳提取工藝為：人參等藥材采用水煎煮提取,加 12倍量水,煎煮2次,每次60 min,濃縮液加95%乙醇至含醇量為70%,靜置12 h,取上清液回收乙醇,濃縮；淫羊藿等藥材采用乙醇回流提取,加 8 倍

8、量的 60% 乙醇溶液,回流兩次,每次 60 min,回收乙醇,濃縮；合并水提和醇提濃縮液,減壓干燥。
　　2 補(bǔ)肺益腎方HPLC指紋圖譜研究表明：十批樣品指紋圖譜間的相似度均達(dá)到0.90以上,全方確定了71個(gè)共有峰,其中指認(rèn)出熊果酸、巖白菜素、馬錢苷、芍藥苷、淫羊藿苷、五味子甲素、五味子乙素、人參皂苷、貝母素甲、貝母素乙等二十個(gè)成分,并對各色譜峰的藥材來源進(jìn)行了歸屬。
　　3 ELISA 結(jié)果顯示：與正常組比較,A

9、549 細(xì)胞 CSE 組 MMP-9 濃度升高(P<0.05),IL-3、IL-8(P<0.05)和TGF-β(P<0.01)濃度降低；LPS組TIMP-1濃度升高(P<0.05),IL-3、TGF-β 濃度降低(P<0.01)。補(bǔ)肺益腎各拆方組均可糾正 CSE 對 A549 細(xì)胞分泌 IL-1β、TGF-β、PPAP2B、CD36 和 LPS 對細(xì)胞分泌 IL-3、SOD的影響；除第11組全方外,其它各拆方組均可以糾正CSE對A549

10、細(xì)胞分泌TNF-α和LPS對細(xì)胞分泌TNF-α、TGF-β的影響。
　　4 譜-效相關(guān)性研究表明：補(bǔ)肺益腎方指紋圖譜中 43、55 號峰(淫羊藿)、66號峰(五味子)、28、47號峰(陳皮)、27號峰(矮地茶)、9、15、24號峰(赤芍)等成分,對矯正 CSE刺激下 A549細(xì)胞分泌 GM-CSF、IL-3、MMP-9、PPAP2B等因子的含量改變有顯著的相關(guān)性；但指紋圖譜中的10號峰(枸杞子)、8號峰(矮地茶)、31號峰(陳

11、皮)、5號峰(山茱萸)等成分,對矯正CSE刺激下 A549 細(xì)胞分泌因子的改變作用較小或呈相反的相關(guān)性。補(bǔ)肺益腎方指紋圖譜中28、47號峰(陳皮)、6、29號峰(矮地茶)、52號峰(人參)、68號峰(五味子)等,對矯正 LPS 刺激下 A549 細(xì)胞分泌 TNF-α、MMP-9、SOD、CD36 等
　　因子的濃度變化有顯著的相關(guān)性；但指紋圖譜中的5號峰(山茱萸)、9號峰(赤芍)、70 號峰(浙貝母)、60 號峰(陳皮)等成分

12、,對矯正 LPS 刺激下 A549細(xì)胞分泌因子的改變作用較小或呈相反的相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1 正交試驗(yàn)優(yōu)選出的補(bǔ)肺益腎方提取工藝穩(wěn)定、高效、簡便易行,為后期新藥研發(fā)的制劑工藝奠定了基礎(chǔ)。
　　2 HPLC法建立了補(bǔ)肺益腎方及其拆方的指紋圖譜,并對其進(jìn)行評價(jià)分析, 10批次樣品間指紋圖譜的相似度均大于0.90,全方共確定了71個(gè)共有峰,均找出了藥材來源,并指認(rèn)出熊果酸、巖白菜素、馬錢苷、芍藥苷、淫羊藿苷

13、、五味子甲素、五味子乙素、人參皂苷、貝母素甲、貝母素乙等二十種化學(xué)成分,可以對復(fù)方藥材質(zhì)量進(jìn)行鑒別,以達(dá)到控制補(bǔ)肺益腎方品質(zhì)和藥效的目的。這與傳統(tǒng)的以單一或某幾個(gè)化學(xué)成分對復(fù)方的質(zhì)量進(jìn)行控制的方式相比,更能很好地反映復(fù)方的質(zhì)量。
　　3 CSE和LPS刺激對肺泡上皮細(xì)胞A549分泌細(xì)胞因子均有一定程度的影響,補(bǔ)肺益腎含藥血清對 CSE 和 LPS 刺激下細(xì)胞因子分泌量的改變有一定的調(diào)節(jié)作用,其中對CSE刺激下A549細(xì)胞分泌I

14、L-1β、TGF-β、CD36、MMP-9、PPAP2B和對LPS刺激下A549細(xì)胞分泌TIMP-1、IL-3、SOD的調(diào)節(jié)最為明顯。不同刺激物對細(xì)胞的因子的影響不同,同一刺激物下不同拆方組含藥血清對細(xì)胞因子的影響也不同,這為闡明補(bǔ)肺益腎方的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為尋找該復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了思路。
　　4 譜-效相關(guān)性研究表明,補(bǔ)肺益腎方中人參、黃芪、淫羊藿、陳皮、赤芍等藥材中主要成分對矯正A549細(xì)胞炎癥因子的濃度變化有