他汀對(duì)高糖情況下微血管纖溶酶原激活物抑制物-1產(chǎn)生的影響及其信號(hào)機(jī)制的研究.pdf

1、血管病變是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，大多數(shù)糖尿病患者死于心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病腎病。糖尿病微血管病變患者發(fā)生心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，因此，對(duì)2型糖尿病微血管病變進(jìn)行關(guān)注和研究，對(duì)于防治大血管事件，減少患者死亡率顯得極為重要。纖溶蛋白溶解系統(tǒng)活性異常是糖尿病微血管并發(fā)癥的因素之一，其中最重要的纖溶抑制物是纖溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor, PAI-1）。PAI-1是聯(lián)系著心腦血管疾

2、病發(fā)生發(fā)展的重要分子。
　　他汀除了降脂以外還具有其他方面的有益作用，如促纖溶、改善內(nèi)皮功能及抗凝聚等作用。他汀是否對(duì)糖尿病微血管并發(fā)癥患者的纖溶功能產(chǎn)生更多的獲益作用，他汀又是通過什么機(jī)制產(chǎn)生促纖溶效應(yīng)的，這些問題是本項(xiàng)研究的主要內(nèi)容。
　　第一部分辛伐他汀對(duì)伴有微血管并發(fā)癥的2型糖尿病患者纖溶酶原激活物抑制物-1的影響
　　目的：觀察辛伐他汀對(duì)2型糖尿?。═2DM）有或無微血管并發(fā)癥患者纖溶酶原激活物抑制物-1（P

3、AI-1）水平的影響。
　　方法：研究129例2型糖尿病，包括50例單純糖尿病及79例糖尿病微血管并發(fā)癥以及56例正常對(duì)照，ELISA法測(cè)定血漿PAI-1的水平，并隨訪糖尿病伴或不伴微血管并發(fā)癥患者服用或不服用辛伐他汀3個(gè)月后PAI-1值的變化。并同時(shí)檢測(cè)一般血脂、血糖生化指標(biāo)。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照相比，糖尿病組PAI-1水平顯著增高（P<0.01），糖尿病微血管并發(fā)癥組 PAI-1水平顯著高于單純糖尿病組（P<0.01）

4、。具有1種微血管并發(fā)癥與同時(shí)合并2種或以上微血管并發(fā)癥的患者相比，PAI-1水平無差異。2型糖尿病患者辛伐他汀治療3個(gè)月均比治療前PAI-1水平顯著降低，其中微血管并發(fā)癥組服用他汀3個(gè)月后PAI-1值較未服他汀的微血管并發(fā)癥組顯著降低，并且降低程度大于他汀治療的單純糖尿病組。
　　結(jié)論：2型糖尿病患者存在纖溶功能受損，其中合并微血管并發(fā)癥者纖溶功能受損較單純糖尿病更為嚴(yán)重。辛伐他汀顯著改善了纖溶功能，微血管并發(fā)癥患者服用辛伐他汀對(duì)

5、纖溶功能的改善更為獲益。
　　第二部分兩種分離大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞方法的比較及改良
　　目的：比較酶消化法和組織塊貼壁法分離成年大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法并進(jìn)行改良，以獲得較高純度和活性的細(xì)胞。
　　方法：分別采用組織塊貼壁法和酶消化法分離大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對(duì)方法進(jìn)行改良。對(duì)分離傳代的細(xì)胞進(jìn)行表面特異性抗原CD31免疫熒光鑒定。
　　結(jié)果：兩種方法都獲得了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD31鑒定細(xì)胞陽性率在9

6、5%以上。兩種方法相比，酶消化法具有獲得所需的細(xì)胞時(shí)間相對(duì)短，穩(wěn)定可靠，細(xì)胞純度高等特點(diǎn)。
　　結(jié)論：使用酶消化法可獲得純度高、狀態(tài)良好的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，該法培養(yǎng)的細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　第三部分他汀抑制高糖誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞纖溶酶原激活物抑制物-1表達(dá)的信號(hào)通路機(jī)制研究
　　目的：通過研究辛伐他汀和阿托伐他汀抑制高糖誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）PAI-1表達(dá)的影響，探討他汀調(diào)控高糖誘導(dǎo)CMEC表達(dá)P

7、AI-1的信號(hào)機(jī)制。
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在含糖5.7 mM至23 mM的培養(yǎng)基作用下，Real-time PCR法測(cè)定PAI-1 mRNA的表達(dá)，ELISA和western blot法分別測(cè)定培養(yǎng)上清及內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1蛋白含量。Pull down法測(cè)定RhoA的活性，western blot測(cè)定IκBα的蛋白表達(dá)，凝膠電泳遷移率（EMSA）測(cè)定IκBα的活化，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定IκBα的轉(zhuǎn)錄活性。

8、r>　　結(jié)果：PAI-1 mRNA及蛋白水平隨著培養(yǎng)基糖濃度的升高而升高，但是辛伐他汀及阿托伐他汀能顯著抑制該效應(yīng)（P<0.01），并且抑制效應(yīng)可被甲羥戊酸（MVA，100μm）及焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯（GGPP，10μm）逆轉(zhuǎn)，而不能被焦磷酸法尼酯（FPP，10μm）所逆轉(zhuǎn)。RhoA抑制劑C3胞外酶（5μg/mL）、RhoA激酶抑制劑 Y-27632（10μm）、羥基法舒地爾（10μm）及NF-κB抑制劑BAY11-7082（5μ