鴨瘟病毒gC基因的發(fā)現(xiàn)、原核表達和應(yīng)用研究.pdf

1、鴨瘟(DuckPlague，DP)，又稱，鴨病毒性腸炎(DuckEnteritis)，是由α-皰疹病毒引起的鴨、鵝等雁行目動物的一種急性敗血和高度接觸性的傳染病。相對其它皰疹病毒而言，DPV研究的總體水平較低，分子生物學(xué)所知甚少。本文對本實驗室發(fā)現(xiàn)的鴨瘟病毒gC基因開展系列研究，獲如下結(jié)果： 1.鴨瘟病毒gC基因發(fā)現(xiàn)、克隆及分子特性分析 對構(gòu)建的鴨瘟病毒(DPV)DNA基因文庫一個重組質(zhì)粒測序，ORFFinder和BLA

2、STN工具初步分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個全長為1296bp的完整ORF片段(ORF1296)。大量生物信息學(xué)分析和斑點雜交證實該ORF與其它皰疹病毒gC基因同源，與禽皰疹病毒gC親緣關(guān)系最近，為DPV的gC基因(GenBank登錄號EU076811)。其大小為1296bp，編碼432個氨基酸，編碼的gC蛋白的理論分子量為45kD，理論等電點(PI)為5.292。推導(dǎo)的gC氨基酸序列的21～24，50～58，67～70，161～171，273～

3、281，387～393位最有可能為抗原表位。 2.鴨瘟病毒gC基因原核表達、產(chǎn)物純化及其抗體制備 根據(jù)發(fā)現(xiàn)的鴨瘟病毒的gC基因序列，設(shè)計一對引物擴增DPVgC基因并將其克隆至pMD18-T載體，經(jīng)酶切和DNA測序鑒定正確后，將DPVgC基因正向插入原核表達載體pET-32a(+)的EcoRI和XhoI位點間，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET32a-gC。將重組表達質(zhì)粒pET32a-gC轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IP

4、TG誘導(dǎo)、SDS-PAGE電泳分析表達出了大小約為65kD的目的重組蛋白。對pET32a-gC表達的融合蛋白Westernblot免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白能與DPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。大量提取pET32a-gC表達產(chǎn)物，純化后免疫家兔成功制備兔抗DPVgc蛋白的多克隆抗體。 3.鴨瘟病毒gC基因原核表達產(chǎn)物免疫原性研究 將經(jīng)純化、復(fù)性的鴨瘟病毒gC基因原核表達蛋白與等量弗氏佐劑混合制備gC重組蛋白疫苗，免疫雛鴨研究對

5、鴨的免疫保護效果。結(jié)果表明：重組蛋白可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，其中和效價和弱毒組變化一致，在免疫后21d達到最高。ELISA檢測的血清抗體消長規(guī)律亦同弱毒組一致。DPVgC重組蛋白對鴨瘟病毒強毒感染具有一定的保護能力。 4.抗gC蛋白抗體介導(dǎo)的免疫組化和免疫熒光檢測DPV建立和應(yīng)用 以飽和硫酸銨沉淀法結(jié)合HighQ陰離子交換柱層析純化的兔抗DPVgC原核表達蛋白的IgG為一抗，分別建立檢測石蠟切片上DPV的SP免疫組化法

6、和間接免疫熒光雙染法。應(yīng)用建立的兩種方法研究DPV-CHv強毒株人工感染雛鴨肝、肺、腎、腦、十二指腸、空腸、回腸、直腸、法式囊、脾臟、腺胃、食道等組織中DPV病毒定殖、動態(tài)變化規(guī)律和gC蛋白在各組織中表達時相。結(jié)果表明：DPV是一種泛嗜性的病毒，SP法和免疫熒光法均可特異檢測到DPV感染鴨肝、肺、腎、腦、十二指腸、空腸、回腸、直腸、法式囊、脾臟、腺胃、食道中DPV抗原的存在。人工感染8h即可在十二指腸、空腸、回腸和直腸中檢測到DPVgC

7、的表達；攻毒12h時，肝、食道、腺胃可檢測到病毒gC表達蛋白；24h可在法式囊、腎和脾臟可檢測到gC表達蛋白;2d在肺、大腦檢測到gC表達蛋白;3d到死亡鴨各組織器官均可持續(xù)檢測到gC表達蛋白存在。 5.抗gC蛋白抗體介導(dǎo)的抗原捕獲ELISA檢測DPV建立和應(yīng)用 以兔抗DPVgC基因原核表達蛋白為第一抗體，以純化的兔抗DPVIgG為夾心抗體，建立并優(yōu)化了檢測DPV的抗原捕獲ELISA方法。結(jié)果表明：gC重組蛋白的最佳包被

8、濃度為1.6μg/孔，檢測血清的最佳稀釋度為1:80，酶標二抗的最佳稀釋度是1:1000。本方法敏感、特異、穩(wěn)定，可應(yīng)用于臨床病料DPV病毒的快速、批量診斷。 6.DPVgC蛋白作為包被抗原檢測鴨瘟抗體間接ELISA建立和應(yīng)用 以純化的DPVgC表達蛋白作為包被抗原初步建立了檢測鴨瘟抗體水平的間接ELISA法(gC-ELISA)，并對該方法進行了標準化研究。用本法(gC-ELISA)和本實驗室研制DPV抗體檢測試劑盒平行

9、檢測56份送檢血清，符合率為94％，表明建立的gCELISA檢測方法具有很好的特異性和敏感性，可以用于DPV感染的診斷和疫苗免疫后的抗體監(jiān)測。 7.基于DPVgC基因的PCR檢測方法建立和應(yīng)用 根據(jù)發(fā)現(xiàn)的DPVgC基因序列，建立檢測DPV的PCR方法。特異性試驗表明，設(shè)計引物對正常DEF細胞、鴨胚尿囊液及鴨肝炎病毒、鴨乙型肝炎病毒、小鵝瘟病毒、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌的核酸提取物進行的PCR的結(jié)果為陰性；而

10、對DPV基因組DNA，其靈敏度可達到1pg;應(yīng)用該PCR方法對DPV感染病料各組織進行檢測，均能擴增出與預(yù)期大小一致的特異性條帶。 8.基于鴨瘟病毒gC基因建立的AC-ELISA、免疫組化、免疫熒光和PCR檢測方法比較 比較AC-ELISA、免疫組化、免疫熒光和PCR對DPVCHv強毒株感染鴨組織和臨床病料檢測結(jié)果的特異性、敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種方法對鴨瘟陽性病料檢測結(jié)果均為陽性，對正常鴨組織、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)