豬瘟病毒E0基因在原核與真核表達系中的表達.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文豬瘟病毒E0基因在原核與真核表達系中的表達姓名：陳振海申請學位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學指導教師：夏春王琴20030501中文摘要豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)E0糖蛋白既是包膜蛋白，又是一種核酸酶，其活性對病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接關(guān)系。鑒于E0蛋白在病毒感染，誘導機體免疫及與宿主細胞相互關(guān)系中的作用，本研究克隆了2株豬瘟病毒EO基因并將其與其它毒株EO基因進行了序列

2、分析，揭示了我國豬瘟病毒流行株之間的遺傳演化關(guān)系，為豬瘟病毒的流行病學研究提供依據(jù)。同時將兔化弱毒株E0基因分別置于原核與真核表達系中進行了表達，并對重組蛋白進行了初步的免疫學分析。首先，采用RTPCR和nestPCR技術(shù)擴增了CSFVJL株和CSFVLN9912株E0基因，插入Teasy載體后測序，應(yīng)用DNAStar50和Bioedit軟件將其與本實驗室已測其它毒株和GeneBank中登錄的CSFV代表毒株EO基因序列進行比較繪制了遺

3、傳進化樹并預(yù)測了E0蛋白的抗原表位、疏水性、等電點等特性。序列分析結(jié)果表明本實驗室所測毒株可分為兩群，15株CSFVE0基因RNase活性的兩個氨基酸基序SLHGIWPE(或G)(2836位)和EWNKHGWC(75—82位)高度保守，僅5個疫苗株SLHGIWPE基序中的E替換為G，基序中位于30和79位的H為PHase催化活性關(guān)鍵氨基酸殘基，高度保守。其次，將豬瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分別插入pGEX4T，pET30，pMAL

4、p2X中，并分別構(gòu)建了以BL21和BL21(DE3)codonplus，BL21(DE3)和BL21(DE3)codonplus，TBl和BL21(DE3)codonplus為宿主菌株的原核表達系。通過摸索IPTG誘導濃度，誘導溫度，菌體收獲時間等條件。確定了E0基因能在pGEX4T／BL21(DE3)codonplus和pMALp2X／BL21(DE3)eodonplus中高效表達表達產(chǎn)量分別占菌體總蛋白的15％和30％，表達的重組蛋

5、白主要為包涵體。分別采用Bper試劑和超聲波裂解配以曲通尿素對包涵體進行洗滌兩種方法在pGEX表達系中取得了較好的效果。使用分步透析法對變性的包涵體進行復(fù)性，將復(fù)性蛋白過GST親和層析柱得到純化的GSTE0融合蛋白。以GSTE0融合蛋白為診斷抗原，初步建立了用間接ELISA檢測豬瘟血清E0抗體的方法。此外，為了得到可溶性重組E0蛋白并便于觀察重組蛋白的表達情況，我們將EGFP基因與E0基因相連插入昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，與線性桿狀病毒D

6、NA共轉(zhuǎn)染sf9細胞后通過噬斑純化得到純的重組桿狀病毒，將其感染sf9細胞制備P1種子液。同時用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況剔除表達效果差的重組桿狀病毒。再用P1種子液感染sf9細胞制各高效價的P2種子液。通過病毒液的梯度稀釋和噬斑測定。確定P2種子液的病毒滴度達114X107pfu／ml。將P2種子液以MOI510接種指數(shù)期sf9細胞，三天后呈現(xiàn)出最強的熒光。我們還將EGFPE0融合基因插入哺乳動物細胞表達載體pCIdhfr中