SQSTM1-p62增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞凋亡抗性的作用機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)腫瘤，嚴(yán)重危害人類(lèi)的身體健康。尋找其有效的基因靶點(diǎn)抑制腫瘤的生長(zhǎng)并進(jìn)行深入的功能研究，對(duì)于提高食管癌患者生存率和改善食管癌治療具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)室前期在研究食管癌抗凋亡基因PKCiota時(shí)發(fā)現(xiàn)，SQSTM1/p62表達(dá)受PKCiota影響，并且臨床食管癌組織標(biāo)本檢測(cè)顯示p62與PKCiota的蛋白表達(dá)正相關(guān)。p62是一個(gè)多功能的泛素化接頭蛋白，在自噬調(diào)控、多條細(xì)胞信號(hào)通路以及腫瘤中發(fā)揮重要作用。目前p62在食管癌

2、中的功能及作用機(jī)制均未有報(bào)道，為此我們對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。
　　我們首先利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析了食管癌細(xì)胞系KYSE150、KYSE180、KYSE510、KYSE450、Eca-109和COLO-680N中p62的表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示p62在COLO-680N細(xì)胞中表達(dá)較低，但在其它食管癌細(xì)胞系中均表達(dá)較高并定位于胞漿。隨后我們選取KYSE450和KYSE180食管癌細(xì)胞系進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)。采用敲降p62對(duì)

3、細(xì)胞表型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)的條件下，改變p62蛋白表達(dá)不影響細(xì)胞增殖、凋亡、集落形成能力和細(xì)胞周期等表型;但經(jīng)過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)12h后，p62蛋白水平降低能明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞集落形成能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p62蛋白表達(dá)降低可抑制裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)。
　　基于在無(wú)血清培養(yǎng)狀態(tài)下，p62促進(jìn)食管癌細(xì)胞抗凋亡能力和細(xì)胞生存活力，我們對(duì)p62影響其細(xì)胞表型相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了探究。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下敲降p62，Western

4、 blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S期激酶相關(guān)蛋白(SKP2)的蛋白水平下調(diào)，同時(shí)采用RT-PCR和Real-Time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SKP2的mRNA水平也降低。饑餓處理狀態(tài)下敲降SKP2可增加食管癌細(xì)胞凋亡水平。進(jìn)一步研究表明p62通過(guò)調(diào)節(jié)PKCiota蛋白表達(dá)而影響SKP2蛋白水平。利用免疫共沉淀(Co-IP)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p62與PKCiota相互結(jié)合。加入泛素化蛋白酶體抑制劑(MG132)作用24h后發(fā)現(xiàn)，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下敲降p62組中SKP2

5、蛋白水平有一定的回升，免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與SKP2相連的多聚泛素化(Ub)蛋白水平明顯增加。
　　隨后我們構(gòu)建了三個(gè)不同的p62結(jié)構(gòu)域缺失突變體，檢測(cè)對(duì)食管癌細(xì)胞表型的影響。結(jié)果顯示p62的PB1結(jié)構(gòu)域具有一定的生物活性，其缺失可明顯降低食管癌細(xì)胞生存活力，同時(shí)在分子水平上證明p62結(jié)構(gòu)中PB1結(jié)構(gòu)域缺失可引起PKCiota蛋白水平的下調(diào)。
　　我們利用PKCiota抑制劑Aurothiomalate(ATM)處理

6、食管癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡均沒(méi)有明顯的作用。但當(dāng)p62-siRNA和ATM聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生存活力和細(xì)胞增殖;同時(shí)在分子水平上分析發(fā)現(xiàn)，p62-siRNA和ATM聯(lián)合處理組中p62、PKCiota和SKP2的蛋白水平均顯著降低。
　　綜上所述，p62通過(guò)PB1結(jié)構(gòu)域與PKCiota相互作用，抑制SKP2蛋白泛素化降解，從而提高食管癌細(xì)胞抗凋亡能力和細(xì)胞生存活力。本研究的結(jié)果綜合提示，p62