p62-SQSTM1通過穩(wěn)定MYC基因mRNA的水平促進乳腺癌干細胞干性的機制研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌被公認為是女性癌癥死亡的首要原因。盡管早期診斷和有效治療極大的降低了致死率，但是仍有很大一部分患者在治療過程中出現(xiàn)了明顯的耐藥和復發(fā)現(xiàn)象。近年來，伴隨著腫瘤干細胞學說研究的興起，越來越多的研究證據(jù)表明，乳腺癌腫瘤干細胞是乳腺癌中極少數(shù)的一部分具有自我更新及多向分化潛能的特殊群體，這一群體驅(qū)動腫瘤對化療藥物產(chǎn)生抵抗并與治療后期出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移及復發(fā)息息相關(guān)。所以，尋找針對腫瘤干細胞治療的特異性靶點，將為惡性腫瘤的治療開辟

2、一條新的途徑。
　　信號樞紐蛋白p62作為一種多結(jié)構(gòu)域多功能蛋白，主要通過與Raptor，TRAF6，RIP1和Keap1等多種信號分子相互作用，廣泛參與細胞內(nèi)多種信號通路的調(diào)控(例如mTOR，NF-κB和NRF2)。眾多的研究結(jié)果表明，多種常見惡性實體瘤(包括乳腺癌)中都存在p62蛋白的異常過表達，但p62如何調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，以及p62蛋白的表達與乳腺癌腫瘤干細胞干性的關(guān)系，尚無系統(tǒng)合理的論證，需要我們?nèi)ミM一步深入探索和研

3、究。
　　方法：
　　(1)①通過ALDH1+細胞群流式分選，獲得乳腺癌腫瘤干細胞群體，通過Western blot和RT-qPCR實驗，比較ALDH1+與ALDH1-群體中p62(SQSTM1)基因和蛋白的表達情況;②通過微球懸浮培養(yǎng)實驗，獲得乳腺癌干細胞群體，比較“干性”微球與普通貼壁細胞兩組之間p62的差異表達情況。
　　(2)①通過ALDH1陽性分析，比較敲降或高表達p62的情況下，乳腺癌細胞中ALDH1陽性比

4、例的變化;②通過體外微球懸浮培養(yǎng)，比較干預p62表達對乳腺癌細胞微球形成能力(直徑、數(shù)目)的影響。
　　(3)體內(nèi)實驗:①通過ALDH1+流式分選的方法，分別從對照組(shNC)和敲降p62(shp62)的MDA-MB-231細胞中分離出具有“干性”的細胞，并通過RT-qPCR驗證兩組干性相關(guān)基因表達情況;②分別從兩組ALDH1+群體中取等量的5×104細胞接種于NOD/SCID雌鼠皮下(每組6只)，培養(yǎng)6周后比較兩組的成瘤率和腫

5、瘤體積。
　　(4)①通過基因表達譜芯片(AFFYMETRIX Human Primeview)對移植瘤組織進行表達譜測序(每組進行三次獨立重復測序);②將表達譜測序結(jié)果(＞1.5倍)與干細胞基因集進行比較分析差異表達基因;③從基因和蛋白水平分別對移植瘤組織中伴隨p62變化的下游靶標進行驗證;④通過對表達譜測序結(jié)果進行基因集富集分析(GSEA)，進一步驗證p62與下游靶標分子之間的關(guān)系。
　　(5)①在乳腺癌細胞系中對p62

6、基因進行瞬時敲降(干擾序列si#1、si#2)以及外源性瞬時過表達，從基因和蛋白水平檢測上述所發(fā)現(xiàn)的差異表達基因的變化;②引入耐受表柔比星的MCF-7(EpiR-MCF-7)細胞系作為高表達干性特征的細胞模型，通過體外微球懸浮培養(yǎng)，將高表達靶標基因的EpiR-MCF-7-shp62組與EpiR-MCF-7-shp62組的微球形成大小和數(shù)目進行比較。
　　(6)①構(gòu)建該差異表達基因的報告基因載體，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，檢測p6

7、2蛋白對該差異表達基因的啟動子活性有無影響;②將細胞系用放線菌素D處理，處理時間分別為0、30、60和90分鐘，收集樣品檢測p62蛋白對該重要基因mRNA半衰期的影響;③通過RNA-IP實驗檢測p62蛋白是否可與該差異表達基因的mRNA直接結(jié)合;④若p62蛋白與該差異表達基因之間沒有結(jié)合，則進一步探索可調(diào)控該差異表達基因mRNA穩(wěn)定性的中間分子(例如microRNA家族)，通過RT-qPCR和Western blot方法進行驗證。

8、>　　結(jié)果：
　　(1)p62在乳腺癌干細胞中的表達情況:①RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于ALDH1-組，ALDH1+細胞中p62的表達量更高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);②RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，微球中p62基因和蛋白的表達量顯著高于貼壁培養(yǎng)細胞，且差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　(2)體外細胞學研究結(jié)果:①ALDH1+流式分析結(jié)果顯示，ALDH1

9、+群體所占比例隨p62表達量的下降而下降，隨p62表達量的升高而升高;②體外微球懸浮培養(yǎng)結(jié)果顯示，敲降p62可顯著降低乳腺癌MDA-MB-231細胞一代、二代微球形成能力(微球直徑變小、數(shù)目減少);高表達p62可增加MCF-7細胞一代、二代微球形成能力。
　　(3)體內(nèi)功能學研究結(jié)果:①RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，通過ALDH1+流式分選方法獲得的“干性”群體中，shp62組中p62，NANOG，SOX2和POU5F1的mRNA表

10、達水平明顯低于shNC組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);②MDA-MB-231對照組成瘤率為100％(6/6);敲降p62組，成瘤率為83.3％(5/6);且相較于對照組，p62敲降組的腫瘤體積明顯減小，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　(4)①②根據(jù)表達譜芯片測序結(jié)果(＞1.5倍)與干細胞基因集進行比對，我們共得到28個差異表達基因(NLE1，SRSF3, POLD2, TDP2, HSPA9, CHEK1，NUD

11、T1，F(xiàn)C5, ITGB3BP, MCM6, ARL4A, LUC7L3, CUL4A, MCM3, SET, NOG, SP1, HMGB1,MRE11A，POLR1C，RFC3，NCRIP，MCM4，GMNN，MYC，BX1);③通過RT-qPCR和Western blot進行驗證，結(jié)果顯示:shp62組中MYC基因的表達水平顯著低于shNC組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);④GSEA結(jié)果顯示，shp62組MYC下游靶基因表達

12、水平顯著低于shNC組。
　　(5)①在乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、BT-549、SKBR-3)對p62基因進行瞬時敲降，可下調(diào)MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;瞬時高表達p62(MDA-MB-231、MCF-7)可上調(diào)MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;②微球懸浮培養(yǎng)結(jié)果表明，在EpiR-MCF-7-shp62細胞中重建MYC高表達能夠逆轉(zhuǎn)因敲降p62所造成的微球形成數(shù)目少、體積小的情況。
　　(

13、6)①Luciferase實驗結(jié)果顯示，p62的高表達沒能引起熒光素酶活性的明顯變化(P＞0.05)(MDA-MB-231、MCF-7);②放線菌素D抑制實驗結(jié)果顯示，對照組MDA-MB-231細胞中MYC基因mRNA的半衰期為38.68分鐘;高表達p62可使MYC基因mRNA的半衰期延長至70.88分鐘;③對RNA-IP所得樣品進行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，p62與同型對照(IgG)組均未檢測到MYC基因mRNA的存在;④RT-qP

14、CR結(jié)果顯示，高表達p62后，let-7家族中l(wèi)et-7a和let-7b的表達水平受到抑制;在p62高表達組中加入let-7a/b的模擬物，可觀察到對照組和實驗組中MYC基因和蛋白的表達水平均顯著下降。
　　結(jié)論：
　　(1)在乳腺癌干細胞干性群體中，p62基因和蛋白表達水平均明顯升高;
　　(2)p62對乳腺癌干細胞干性的維護起到重要的作用;
　　(3)干預p62表達可引起MYC基因mRNA水平的變化;MYC在