GSK3β在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其與P38MAPK相關(guān)性的研究.pdf

1、GSK3β是糖原合成激酶 3（glycogen synthesis kinase，GSK-3）的亞型之一。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)，GSK3β不僅僅參與糖原代謝過(guò)程，它更是一個(gè)多功能激酶，在蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及腫瘤發(fā)生等方面都扮演了重要角色。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用，并參與了乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路調(diào)控。但是，GSK3β是否參與了乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移仍然是個(gè)有待于研究的問(wèn)題

2、。p38MAPK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成員。最近，p38MAPK信號(hào)通路因以正性調(diào)節(jié)的方式參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程而倍受關(guān)注。為此，本研究檢測(cè)了 p-p38，p-GSK3βser9，GSK3β在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步研究GSK3β在乳腺癌侵襲中的作用以及GSK3β和p38MAPK 通路的關(guān)系，為乳腺癌治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　

3、材料與方法：
　　 1、材料
　　 （1）細(xì)胞系 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s，原購(gòu)自北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實(shí)驗(yàn)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)已有的細(xì)胞復(fù)蘇而得。
　　 （2）主要試劑 鼠抗人p-p38抗體購(gòu)自Cell signaling 公司。兔抗人 GSK3β抗體購(gòu)自 Bioworld 公司。兔抗人 p-GSK3βser9抗體購(gòu)自 Santa 公司。p38MAPK特異性抑制劑

4、SB203580購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。GSK3β特異性抑制劑SB216763購(gòu)自Cayman公司。Transwell 小室（孔徑8um）購(gòu)自 Corning 公司。
　　 2、方法
　　 （1）Western 印跡法 收集細(xì)胞加入RITA buffer 裂解液，超聲處理，高速低溫離心提取總蛋白，用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印，封閉后加相應(yīng)一抗、二抗。ECL發(fā)光，觀察拍照，進(jìn)

5、行灰度值測(cè)定。
　　 （2）免疫熒光染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞接種到孔板中。固定、TritonX-100處理、封閉后加相應(yīng)一抗、二抗，復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。
　　 （3）Transwell 實(shí)驗(yàn) Transwell小室接種細(xì)胞后培養(yǎng)，擦去上室內(nèi)細(xì)胞后固定，染色，觀察拍照，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)處理：采用t檢驗(yàn)分析Western Blot圖像灰度值

6、、Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)，用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各樣本均數(shù)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、p-p38、p-GSK3βser9，GSK3β在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 （1）Western 印跡法檢測(cè)，在三種乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s 中，p-GSK3βser9 和p-p38的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，GSK3β表達(dá)無(wú)明顯差別。
　　

7、 （2）選取p-p38，p-GSK3βser9均高表達(dá)的高侵襲高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-435s，免疫熒光定位顯示：p-p38在MDA-MB-435s中主要表達(dá)在細(xì)胞核，細(xì)胞漿中僅有微弱的表達(dá)；而p-GSK3βser9在 MDA-MB-435s 中主要表達(dá)在細(xì)胞漿，細(xì)胞核中僅有微弱的表達(dá)。
　　 2、GSK3β抑制劑LiCL和SB216763作用MDA-MB-435s細(xì)胞系24h后p-GSK3βser9和GSK3β變化
　

8、　 （1）Western 印跡法檢測(cè)顯示：LiCL和SB216763均可上調(diào)p-GSK3βser9表達(dá)水平，GSK3β無(wú)明顯變化。
　　 （2）免疫熒光定位顯示：SB216763 作用 MDA-MB-435s 細(xì)胞系24h后p-GSK3βser9胞漿表達(dá)減少，核表達(dá)增多。
　　 （3）Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示：SB216763 能濃度依賴性地增加乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435s的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　 3、P

9、38MAPK抑制劑SB203580對(duì)GSK3β活性的影響
　　 Western 印跡法檢測(cè)顯示，SB203580 濃度性依賴性的地下調(diào) MDA-MB-435s中 p-p38，p-GSK3βser9蛋白的表達(dá)，但不影響GSK3β蛋白的表達(dá)。
　　 討論：
　　 GSK3β是一個(gè)多功能的蛋白激酶，它在蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮重要作用。GSK3β的活性主要通過(guò)3種不同方式共同調(diào)節(jié)：（1）不同位點(diǎn)

10、的磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié) GSK3β活性。在N端絲氨酸9（Ser9）處磷酸化可降低GSK3β活性，而在酪氨酸 216（Tyr216）處磷酸化則可增強(qiáng)它的活性；（2）細(xì)胞內(nèi)定位調(diào)控GSK3β活性。GSK3β大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中，但轉(zhuǎn)位入核后 GSK3β對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)控、促進(jìn)腫瘤發(fā)生的活性才得以發(fā)揮；（3）底物磷酸化水平的不同調(diào)控GSK3β活性。大部分GSK3β的底物都必須首先被其他激酶磷酸化（一次磷酸化），才能被GSK3β識(shí)別并受其磷酸化（二次

11、磷酸化）。因此底物的磷酸化水平改變底物的可識(shí)別性，從而調(diào)控GSK3β的活性。目前，有關(guān)GSK3β對(duì)腫瘤的作用究竟是抑癌還是促癌，尚無(wú)定論。
　　 p38MAPK 信號(hào)通路能通過(guò)磷酸化作用激活多種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，包括c-Jun，c-fos，和ATF2?；罨膒38MAPK還可激活轉(zhuǎn)錄因子MEF2C、ELK-1、MAX和CHOP。另外，P38 通路還參與細(xì)胞骨架蛋白的合成，應(yīng)用p38MAPK抑制劑SB203580可抑制細(xì)

12、胞的運(yùn)動(dòng)。
　　 本文通過(guò)觀察GSK3β的活性變化對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s侵襲力的增加，p-GSK3βser9蛋白表達(dá)呈遞增趨勢(shì)；而總GSK3β表達(dá)無(wú)明顯差別，提示GSK3β活性與乳腺癌侵襲力負(fù)相關(guān)。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著抑制劑 GSK3β抑制劑 SB216763的濃度增加，MDA-MB-435s 細(xì)胞的侵襲力是逐漸升高的。也就是說(shuō)

13、GSK3β活性的降低可以增加乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-435s的侵襲能力。我們又進(jìn)一步進(jìn)行了乳腺癌細(xì)胞系免疫熒光定位，結(jié)果顯示：p-GSK3βser9主要定位于細(xì)胞漿。而SB216763作用MDA-MB-435s 細(xì)胞系24h后 p-GSK3βser9核表達(dá)增多，漿表達(dá)減少。說(shuō)明p-GSK3βser9可通過(guò)核內(nèi)外運(yùn)動(dòng)來(lái)改變GSK3β的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。已證實(shí)，GSK3β在胞漿、胞核及線粒體內(nèi)都存在，與胞漿相比，胞核及

14、線粒體部位的GSK3β活性更高。胞核中的GSK3β調(diào)節(jié)了很多轉(zhuǎn)錄因子，其在胞核中水平不是恒定的，而是根據(jù)胞內(nèi)一些因素的改變而發(fā)生劇烈變化。所以我們推測(cè)胞核中的GSK3β可能在調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲基因方面發(fā)揮更為主要的作用。
　　 許多研究發(fā)現(xiàn)了GSK3β和P38MAPK存在一定的聯(lián)系，那么兩者在乳腺癌中的關(guān)系如何呢?我們采用不同濃度P38MAPK特異性抑制劑SB203580作用于MDA-MB-435s細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SB2035

15、80可以濃度依賴性地下調(diào)乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-435s中pGSK3βser9蛋白表達(dá)水平。也就是說(shuō)抑制P38MAPK通路可能直接或間接下調(diào)pGSK3βser9表達(dá)水平，從而增加GSK3β活性，進(jìn)而在乳腺癌的侵襲中發(fā)揮一定的作用，但其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　 我們的結(jié)果顯示，抑制GSK3β活性可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力，并且在乳腺癌細(xì)胞系中GSK3β3和P38MAPK之間呈負(fù)相關(guān)。目前，GSK3β和p38MA