犬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及fimN基因的克隆、表達(dá)和表達(dá)蛋白免疫原性分析.pdf

1、犬窩咳是由犬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)犬腺病毒(CAV)、犬瘟熱(CDV)和犬副流感病毒(CPiV)中的一種或幾種病原混合感染引起的。本實(shí)驗(yàn)主要目的是了解犬支氣管敗血波氏桿菌在窩咳犬中的分布，分析比較Bb分離株的生物學(xué)特性，并同時(shí)比較三種病毒在窩咳犬中的檢出。從南京地區(qū)和北京地區(qū)采集了164份患有窩咳的犬鼻腔拭子進(jìn)行Bb的分離鑒定，經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)檢查、生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定及PC

2、R鑒定，最終分離到16株Bb，分離率為9.8％，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示16株細(xì)菌生物學(xué)特性和對(duì)抗生素敏感性基本相同。對(duì)16份Bb陽(yáng)性病料樣品進(jìn)行犬腺病毒、犬瘟熱、犬副流感病毒檢測(cè)，結(jié)果表明窩咳犬由Bb引發(fā)的凡率占10％，和三種病毒混合感染的情況者占81％。 對(duì)2006年11月至2008年1月在北京和南京地區(qū)分離的16株犬波氏桿菌和一株兔波氏桿菌參考株的fimN基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆，用MegAlign(DNAStar)比較分析分離株與Ge

3、nBank中收錄的犬波氏桿菌參考株(登錄號(hào)AF231910)的fimN核苷酸序列，繪制基因進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，16株支氣管敗血波氏桿菌的fimN基因序列同源性與犬波氏桿菌參考株序列的同源性在99％以上，和兔波氏桿菌參考株的序列同源性也在99％以上，表明南京和北京兩地的犬源支氣管敗血波氏桿菌的fimN核苷酸序列基本無(wú)變化。 對(duì)克隆載體pMD18T-fimN進(jìn)行雙酶切，將得到的630bp片段以正確的閱讀框架定向克隆于pET-32a(+

4、)中，構(gòu)建PETBb-fimN重組質(zhì)粒表達(dá)載體，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中，在37℃1mM IPTG誘導(dǎo)下該片段獲得良好的表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定其表達(dá)的融合蛋白質(zhì)約39.4kDa，與預(yù)期值一致，免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示，體外表達(dá)的該重組蛋白可被兔支氣管敗血波氏桿菌NK0610株兔抗血清識(shí)別。表達(dá)蛋白純化后免疫實(shí)驗(yàn)兔，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示血清的沉淀效價(jià)為1:40，表明該重組蛋白具備天然菌毛蛋白N基因的部分抗原表