兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及其外膜蛋白免疫效果的研究.pdf

1、兔支氣管敗血波氏桿菌病是由支氣管敗血波氏桿菌引起的一種常見兔呼吸道疾病。主要引起哺乳仔兔和斷乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支氣管炎和膿皰性肺炎等，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成很大的危害。2006年以來，山東省某一大型兔場(飼養(yǎng)新西蘭肉種兔2400余只)，所產(chǎn)仔兔(共計(jì)465只)，均在20～30日齡發(fā)病，表現(xiàn)為精神不振，多數(shù)病兔鼻腔流出膿性鼻液，周圍的被毛沾有粘液膿性分泌物，后期出現(xiàn)結(jié)痂，隨著病程的延長，逐漸表現(xiàn)為呼吸困難，并出現(xiàn)鼻鼾聲，體況瘦弱，下痢

2、拉稀。為了進(jìn)一步探討引起該規(guī)?；脠龊粑兰膊〉脑?，本研究通過病原學(xué)檢查，對(duì)主要病原進(jìn)行了分離鑒定和分子生物學(xué)特性的研究，同時(shí)對(duì)分離到主要病原菌的外膜蛋白提取后進(jìn)行了免疫原性研究，為規(guī)模化種兔場呼吸道疾病的防治提供了理論依據(jù)。 本研究共分2部分： 一、兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及其分子生物學(xué)特性的檢測2006年，山東省某一大型養(yǎng)兔場的20～30日齡的幼兔突然大批發(fā)病死亡。病兔早期精神不振，多數(shù)病兔鼻腔流出膿性鼻液，

3、隨著病程的延長逐漸表現(xiàn)為呼吸困難，并出現(xiàn)鼻鼾聲，以體況瘦弱，下痢拉稀為主要癥狀。從中主要分離到4株細(xì)菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)反應(yīng)特性等可將分離菌鑒定為兔支氣管敗血波氏桿菌。然后對(duì)所分離到的兔支氣管敗血波氏桿菌P13菌株進(jìn)行(G+C)mol％含量的測定以及16SrRNA的擴(kuò)增，結(jié)果(G+C)mol％含量為61.7～62.4％，與KerstersK結(jié)果相符(61.6～62.6％)；而該菌16SrRNA核苷酸序列與Ge

4、nbank中收錄的AF177666株禽波氏桿菌菌株核苷酸序列同源性為82.7％，與本實(shí)驗(yàn)室保存的兔支氣管敗血波氏桿菌菌株P(guān)11菌株及參考菌株同源性高，分別為99.7％和99.9％。最后利用所分離到的兔支氣管敗血波氏桿菌菌株制備免疫原，通過免疫仔兔，使仔兔獲得抗體，而使幼仔兔獲得保護(hù)，并且效果較好。 二、兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白的提取及其免疫效果的檢測本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究支氣管敗血波氏桿菌的外膜蛋白(OMP)和其中

5、的有效保護(hù)抗原成分(OMP68)的免疫原性及免疫保護(hù)作用。本研究利用改進(jìn)的Wooldridge的方法提取了支氣管敗血波氏桿菌P11和P13的OMP，利用SDS-PAGE電泳比較了兩株之間差異，采用Western-blotting進(jìn)行了分析并確定了P13菌株OMP(P13-OMP)中的有效保護(hù)性抗原成分，采用電洗脫方法獲得分子量為68KD的P13-OMP中的有效保護(hù)抗原成分(OMP68)，然后制備了油乳劑P13的全菌、P13-OMP和OM

6、P68免疫抗原?？贵w動(dòng)態(tài)變化：將清潔級(jí)小鼠70只隨機(jī)分成7組，10只/組，用油乳劑P13的全菌和不同劑量的P13-OMP和OMP68免疫抗原分別免疫，采用間接ELISA檢測免疫小鼠的相應(yīng)抗體水平并分析抗體動(dòng)態(tài)變化；主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)：將清潔級(jí)小鼠80只隨機(jī)分成8組，10只/組，分別采用制備的油乳劑P13-OMP(OMP25μg/只)、OMP68(25μg/只)和P13菌體免疫抗原在免疫10d后，分別用100LD50的P11和P13腹腔攻毒

7、，然后統(tǒng)計(jì)保護(hù)率并分析免疫原所提供的免疫保護(hù)力。免疫P13-OMP和OMP68油乳劑抗原后，7d時(shí)，抗體水平開始逐漸上升，42d時(shí)，抗體水平分別達(dá)到215.3和214.8，然后逐漸下降，70d時(shí)，抗體水平分別達(dá)到29.1和210.2。主動(dòng)免疫時(shí)，P11和P13攻毒的P13-OMP免疫組分別均得到9/10和9/10的保護(hù)，OMP68免疫組分別均得到9/10和10/10的保護(hù)，而P13全菌免疫組分別得到4/10和6/10保護(hù)，對(duì)照組全部死亡