ATM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討ATM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　（1）利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌癌旁腫瘤組織（以下簡(jiǎn)稱正常乳腺組織）、侵潤(rùn)、侵潤(rùn)伴轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中p-ATM蛋白的表達(dá)；乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞分別經(jīng)常氧（21% O2）和低氧（1%O2）處理后，細(xì)胞免疫熒光和Western Blot檢測(cè)p-ATM和總ATM表達(dá)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力.

2、　?。?）利用shRNA技術(shù)和ATM特異性抑制劑Ku60019抑制乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中ATM功能，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　　（3）BT549細(xì)胞Ku60019處理組和溶劑對(duì)照組做磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，利用DAVID軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析，篩選與遷移和侵襲相關(guān)的靶蛋白。
　?。?）利用IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因與ATM相互作用并受其調(diào)控，采用shRNA技術(shù)敲低靶

3、蛋白，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　?。?）利用定點(diǎn)突變技術(shù)，Transwell實(shí)驗(yàn)，IP實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞應(yīng)力纖維染色技術(shù)驗(yàn)證靶蛋白特異性磷酸化位點(diǎn)功能。
　　結(jié)果：
　?。?）隨著乳腺腫瘤分級(jí)的增加，p-ATM蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)；與常氧組相比，低氧處理后p-ATM表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。
　　（2）ATM敲低或抑制后，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。
　?。?）磷酸化蛋白質(zhì)組

4、學(xué)分析結(jié)果顯示，ATM下游靶蛋白主要參與細(xì)胞間粘附過(guò)程，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等信號(hào)通路。結(jié)合文獻(xiàn)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)選擇與遷移侵襲相關(guān)的靶蛋白為CTTN，其特異性磷酸位點(diǎn)為S113。
　?。?）IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATM可以磷酸化CTTN S113位點(diǎn)，敲低CTTN的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。
　?。?）利用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CTTN S113位點(diǎn)磷酸化可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲。進(jìn)一步通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞應(yīng)力纖維染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTT