宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)豬臍帶動靜脈血Exosome中microRNA轉(zhuǎn)錄組的鑒定和表達(dá)譜分析.pdf

1、臍帶血是連接母體與胎兒的紐帶，是胚胎發(fā)育時期能量、營養(yǎng)物和代謝廢棄物的傳輸通道，能滿足胎兒機(jī)體生長、發(fā)育以及維持機(jī)體的健康狀態(tài)。動物體液中的microRNAs(miRNAs)通常被選擇性地包被在exosome中。Exosome是由多種類型的細(xì)胞所分泌的帶膜囊泡，能將大量特異性的miRNAs主動地定向輸送到受體細(xì)胞，并調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)和受體細(xì)胞的功能。本研究中，在利用原子力顯微鏡(Atomic force microscope，AFM)證

2、實豬臍帶血中存在大量exosome的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了具有代表性的同窩出生健康仔豬和IUGR豬的臍帶動脈血和靜脈血exosome small RNA文庫。用高通量測序的方法分析和注解了豬臍帶動脈和靜脈血exosome中的miRNA表達(dá)譜，并用熒光定量方法驗證。另外，對在臍靜脈和動脈血中高表達(dá)的miRNAs以及IUGR與正常豬差異表達(dá)miRNA進(jìn)行了功能分析。主要結(jié)果如下:
　　(1)以超高速離心的方法從豬臍帶血中分離得到含量較豐富的e

3、xosome。通過AFM在納米水平觀察到豬臍帶動靜脈血exosome的大小符合正態(tài)分布，臍靜脈血exosome平均寬度在120 nm左右，高度在17nm左右，臍動脈血exosome平均寬度在130nm，高度在20nm，與前人報道的人唾液和豬乳汁中exosome的大小相近。
　　(2)通過建庫測序，正常豬臍動脈血(ND)和靜脈血(NJ)以及IUGR豬臍動脈血(ID)和靜脈血(IJ) exosome small RNA文庫有效序列分別

4、占到了總reads數(shù)的83.3％、81.9％、67.57％和62.74％。這些有效序列的長度大多在20～24nt之間，這些讀數(shù)的長度是典型的Dicer酶加工產(chǎn)物長度，符合miRNA的基本結(jié)構(gòu)特征。
　　(3)生物信息學(xué)分析表明，在4個豬臍帶血exosome small RNA文庫中一共檢測到554種pre-miRNAs和636種成熟miRNAs。其中，在4個文庫鑒定到的保守miRNAs成熟體和前體分別有292個和260個。

5、　　(4)每個文庫中表達(dá)量前10的miRNAs占總量的60％以上。對Top10的miRNAs功能分析發(fā)現(xiàn)，臍靜脈血中高表達(dá)的miRNAs主要參與紅細(xì)胞生成、血管生成和血管疾病;臍動脈血還參與血管發(fā)育、免疫以及細(xì)胞因子應(yīng)答等多個過程。
　　(5)不同文庫間兩兩比較表明，NJ與ND共有122個差異基因(p＜0.001)，其中60個在NJ中高表達(dá)，62個在ND中高表達(dá);NJ與IJ共有116個差異基因(p＜0.001)，其中89個在NJ中

6、高表達(dá)，27個在IJ中高表達(dá);ND與ID共有226個差異基因(p＜0.001)，其中127個在ND中高表達(dá)，99個在ID中高表達(dá)。
　　(6)篩選差異miRNAs進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示NJ與ND比較，13個上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞生長、血管形成以及胚胎發(fā)育中等通路，7個下調(diào)基因主要富集對低氧環(huán)境的應(yīng)答、調(diào)控細(xì)胞的凋亡以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對免疫應(yīng)答通路;NJ與IJ比較，16個上調(diào)基因主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、細(xì)胞增殖、生長通路，5個下調(diào)

7、基因主要富集在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、GTP酶調(diào)節(jié)活性通路;ND與ID比較，16個上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞死亡、凋亡、p53信號通路，5個下調(diào)基因主要富集在負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞程序性死亡以及MAPK信號通路中。表明臍帶動靜脈血之間存在功能差異，并推測IUGR豬臍帶血exosome中miRNAs的表達(dá)差異與IUGR豬表型的形成有一定的關(guān)系。
　　(7)對4個文庫中差異表達(dá)的miRNAs聚類分析表明母體子宮內(nèi)環(huán)境通過臍帶血對IUGR豬的影響小于胎

8、兒自身發(fā)育功能障礙。對IUGR豬和正常豬臍帶血exosome中主要差異miRNAs功能分析發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)氧氣運(yùn)輸和調(diào)節(jié)的miRNAs(miR-210、miR-424-3p、miR-27、miR-26a、miR-24、miR-181a、miR-23b、miR-26b、miR-130b、miR-107)在IJ中表達(dá)下調(diào)、抑制氧氣運(yùn)輸?shù)膍iRNAs(miR-223、miR-24、miR-138)在IJ中表達(dá)上調(diào);促進(jìn)血管生成的miRNAs(miR

9、-130a、miR-200c、miR-150、miR-17～92、miR-126、miR-378、miR-221、miR-93、miR-34a)在IJ和ID中表達(dá)下調(diào)，抑制血管生成的miRNAs（miR-16、miR-34a、miR-222）在IJ和ID中表達(dá)上調(diào);促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育的miRNAs(miR-181a、miR-150、miR-155)在IJ和ID中表達(dá)下調(diào)，而抑制免疫系統(tǒng)發(fā)育的miRNA(miR-146a)在IJ和ID中表達(dá)

10、上調(diào);促進(jìn)代謝相關(guān)的miRNAs(miR-223、miR-210、let-7)在ID中表達(dá)上調(diào)，相反，抑制這個過程的miRNAs（miR-143、miR-199a-5p）在ID中表達(dá)上調(diào)。上述生理過程都是胚胎健康發(fā)育的必要條件，說明臍帶血中的miRNAs參與了胚胎氧氣傳輸、血管形成、免疫系統(tǒng)發(fā)育和能量代謝方面的調(diào)控，這些通路異常可能是導(dǎo)致IUGR豬形成的重要原因，IUGR的形成受到了宮內(nèi)胚胎發(fā)育過程中臍帶動靜脈血exosome中miRN