人真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞向胰島分化的研究.pdf

1、種子細(xì)胞由于其供體來(lái)源和擴(kuò)增能力有限，一直以來(lái)成為組織工程學(xué)發(fā)展的瓶頸。干細(xì)胞研究的發(fā)展，為尋找種子細(xì)胞來(lái)源帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞便是其中的焦點(diǎn)，但仍面臨數(shù)量不足、造血干細(xì)胞損失等難題。位于人真皮層的成纖維細(xì)胞數(shù)量眾多、易于培養(yǎng)擴(kuò)增。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于人真皮層的成纖維細(xì)胞中存在著少量具有多向分化能力的多潛能細(xì)胞，這將成為組織干細(xì)胞家族中的新成員。為此，本課題擬對(duì)人真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞的單細(xì)胞克隆進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究，以

2、證實(shí)其是否具有多胚層分化的潛能，并探尋其向胰島樣細(xì)胞分化的能力，為治療I型糖尿病的胰島細(xì)胞移植提供一種新型的種子細(xì)胞來(lái)源。 目的: 本研究旨在揭示真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞的干細(xì)胞特性，通過(guò)將真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞的單細(xì)胞克隆在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后向脂肪、骨等中胚層誘導(dǎo)，向神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)，以及向肝臟內(nèi)胚層誘導(dǎo)研究其是否具有多胚層分化的潛能；通過(guò)對(duì)真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞單細(xì)胞克隆在體外向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后并將其植入糖尿病模型鼠體內(nèi)

3、，研究其是否在體外、體內(nèi)具有胰島樣細(xì)胞的特性及功能，為臨床I型糖尿病治療的胰島細(xì)胞移植提供一種新型的種子細(xì)胞來(lái)源。 方法: 我們從患者年齡在6-12歲的14例臨床包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的正常皮膚組織中分離得到真皮成纖維樣細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行低密度接種，研究真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞的單細(xì)胞克隆形成能力，并進(jìn)一步挑選出單細(xì)胞克隆，在體外進(jìn)行適量擴(kuò)增后向中胚層、外胚層和內(nèi)胚層分化。通過(guò)特殊染色和免疫熒光化學(xué)檢測(cè)等方法對(duì)誘導(dǎo)能力進(jìn)行

4、鑒定。進(jìn)一步將這些單細(xì)胞克隆在體外特定條件下向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，從形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)表達(dá)和基因水平上，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并通過(guò)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)研究經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)適當(dāng)濃度的葡萄糖刺激得反映。將在體外向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞與I型鼠尾膠原混合的細(xì)胞材料復(fù)合物移植到糖尿病裸鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)其體重和血糖的變化情況，研究其是否具有類(lèi)似胰島的降血糖功能。 結(jié)果: 真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞在體外低密度培養(yǎng)時(shí)具

5、有一定的克隆形成能力，經(jīng)過(guò)5-6周的培養(yǎng)與擴(kuò)增最終獲得61個(gè)真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞單細(xì)胞克隆。細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形。這些克隆在體外向中胚層誘導(dǎo)后，OilRed O檢測(cè)成脂肪誘導(dǎo)3周后可見(jiàn)到較多的脂肪細(xì)胞；經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后3周，ARS檢測(cè)顯示較多的鈣化結(jié)節(jié)成。向外胚層神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)10天后，部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多極化改變，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)到部分細(xì)胞有NF-M、NTR3及GAP-43的表達(dá)。向內(nèi)胚層肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)14天后，部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)鋪路石樣改變

6、，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)到部分細(xì)胞表達(dá)ALB及HNF-3β。61個(gè)單細(xì)胞克隆中，具有三胚層分化潛能的克隆的數(shù)量為兩個(gè)，占所有克隆個(gè)數(shù)的3.3％。具有三胚層分化潛能的單細(xì)胞克隆在體外特定條件下向內(nèi)胚層胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，兩周后細(xì)胞聚集形成類(lèi)似胰島的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，免疫熒光化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該團(tuán)塊有胰島內(nèi)分泌激素，如胰島素、胰高血糖素和SOM的表達(dá)，RT-PCR從基因水平上檢測(cè)到誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)了胰島細(xì)胞分化過(guò)程中的相關(guān)基因，如：insulin、gluc

7、agon、ISL-1、PDX-1、NeuroD等，并能夠?qū)m當(dāng)濃度的葡萄糖刺激能夠產(chǎn)生應(yīng)答，分泌胰島素。體外誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞移植到糖尿病裸鼠體內(nèi)后能在短期內(nèi)明顯降低其血糖。證實(shí)了真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞具有向胰島樣細(xì)胞分化的潛能，并能夠在體內(nèi)發(fā)揮類(lèi)似胰島的生理功能。 結(jié)論： 真皮多潛能成纖維樣細(xì)胞中存在著具有多胚層分化能力的干細(xì)胞，而且這種干細(xì)胞是一種可以向胰島樣細(xì)胞分化的全能干細(xì)胞，是組織工程領(lǐng)域中的一種新型種子細(xì)胞