鱘源海豚鏈球菌的分離鑒定及莢膜多糖基因的進化分析.pdf

1、2013年8-9月，四川雅安漢源湖養(yǎng)殖的西伯利亞鱘發(fā)生一種以體表潰瘍、內(nèi)臟出血和心外膜囊腫為特征的傳染病。為明確其病因，本研究從自然發(fā)病魚的肝、脾和腎進行涂片檢查和病原菌的分離、人工感染、分離菌的表型特征和分子生物學特征的檢測。肝臟和脾臟涂片均觀察到大量的革蘭氏陽性球菌，從患病魚體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢菌，革蘭氏染色呈G+鏈狀球菌(Ab130920)。人工感染實驗證實分離株能夠引起試驗魚高死亡率，明確了其病原性。生理生化特性檢測，除對精氨酸和

2、乳糖反應外，與海豚鏈球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）(ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登錄號:KJ162337)與GenBank中S.iniae16SrDNA序列同源性最高，在以16SrDNA序列及其GenBank中同源性較高的相關序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，分離菌與S.iniae聚為一族;同時，在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特異性PCR檢測中，從分離株基因組DNA擴增出

3、預期大小的870 bp條帶，綜合表型特征和分子學特征檢測結果，進而鑒定分離菌Ab130920為S.iniae。藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)其對阿莫西林、強力霉素、氟苯尼考等抗菌藥物敏感，但對新生霉素、利福平、氧氟沙星耐藥。
　　為研究其毒力，本試驗進行了血清殺菌實驗、血清學分型、對EPC細胞的粘附和侵染實驗、毒力基因檢測和自然發(fā)病魚的病理學損傷研究。結果表明，菌株在健康西伯利亞鱘的血清中存活率為66.2％，說明血清僅能夠殺死部分細菌，存活細

4、菌可能隨著血液循環(huán)引起全身性的感染;通過對精氨酸和乳糖反應以及隨機擴增多態(tài)性DNA標記分析，證實Ab130920為血清學Ⅱ型;其對EPC細胞的粘附率為3.28％，侵入率為0.08％，證明菌株可粘附在宿主細胞表面進而進入細胞內(nèi)定殖;在對cpsD、simA、sagA、pdi和scpI等5種S.iniae毒力基因的多重PCR檢測中，分離菌均擴增出相應大小的特異性片段，表明其為一毒力較強的菌株，與人工感染實驗的高致病性結果相佐證;組織病理學表明

5、，Ab130920引起西伯利亞鱘全身性感染，導致多個組織器官的出血、細胞變性和壞死，尤其是肝、腎、脾、心和肌肉的嚴重損傷，表現(xiàn)為壞死性肝炎、肝血管炎、腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的壞死性肌炎;另外鰓、胃腸道、腦和胰腺也出現(xiàn)不同程度的損傷，表現(xiàn)鰓小片炎、胃炎、腸炎、腦膜炎和胰腺廣泛性出血。
　　為研究其莢膜多糖基因的進化關系，對菌株Ab130920和標準菌株ATCC29178的莢膜多糖基因進行PCR擴增，

6、并克隆測序，獲得其序列，并與相關文獻和GenBank中莢膜多糖基因進行多序列比對，明確莢膜多糖基因的變異性，分析其堿基突變引起相應氨基酸的改變。選擇變異性較大的基因cpsD，與相關文獻和GenBank中的莢膜多糖基因序列進行貝葉斯進化分析。結果表明，S.iniae莢膜多糖基因存在變異的有cpsY、 cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因，特別是cpsD和cpsE;變異基因在相應位點發(fā)生插入、缺失或移碼突變，引起相應氨基酸改