Riemerella anatipestifer的分離鑒定及莢膜多糖研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,簡稱RA)引起鴨的傳染性漿膜炎(Infectiousserositis),是危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原之一。鴨疫里默氏桿菌的血清型復(fù)雜,現(xiàn)被公認(rèn)的有21個血清型,各血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)。在生產(chǎn)實際中,主要利用抗菌藥物進(jìn)行鴨傳染性漿膜炎的預(yù)防和治療,但耐藥性越來越嚴(yán)重。因此,進(jìn)行鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定,弄清流行菌株的優(yōu)勢血清型及耐藥性等是當(dāng)前及今后一段時間內(nèi)防治此病必須優(yōu)

2、先考慮的工作。本試驗自2004年9月至2005年5月從重慶和四川地區(qū)收集可疑患病鴨、鵝,并進(jìn)行鴨疫里默氏桿菌分離鑒定,弄清了流行菌株的血清型及耐藥性,為該地區(qū)鴨傳染性漿膜炎的有效防治提供了保障；另一方面,我們提取了細(xì)菌的莢膜成分,并純化獲得英膜多糖及對莢膜多糖的單糖組成、生物學(xué)特性等進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步研究鴨疫里默氏桿菌的莢膜多糖奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.自2004年9月至2005年5月從重慶和四川地區(qū)收集的

3、漿膜炎可疑病料中利用巧克力瓊脂平板分離培養(yǎng),通過形態(tài)觀察、生化鑒定、致病性測定及PCR擴(kuò)增協(xié)同溶血素基因(cam)等鑒定出64株鴨疫里默氏桿菌。
　　 2.利用平板凝集試驗和瓊脂雙擴(kuò)散試驗將64株分離細(xì)菌分為8個不同血清型,其中GNRA、HNDJ和MY為新血清型,占總分離數(shù)的15.6％。生長曲線測定表明細(xì)菌在12-14小時達(dá)到生長高峰；鴨源和鵝源株對10日齡鴨的半數(shù)致死量(LD50)分別為1.9×107和6.0×107CFU/m

4、l；體外抗生素敏感性測定表明對頭孢三嗪、利福平、新霉素、頭孢唑啉、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素的敏感率分別為66％、64％、61％、55％、52％、48％、45％。
　　 3.在20℃條件下,利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)從鴨疫里默氏桿菌改良馬丁肉湯培養(yǎng)物中提取出乳白色泥狀、真空干燥后呈白色疏松狀的莢膜提取物；經(jīng)sevag法脫蛋白、DEAE-Sepharose和SephadexG-200層析法純化,得到AF、BSY、HND

5、J及MY株的莢膜多糖,其中糖含量分別為54.0、33.5、31.6和37.6ug/ml,蛋白含量分別為10.3、20.3、11.0和11.4ug/ml,核酸含量分別為4.2、5.0、4.1和5.3ug/ml。在分子篩層析中,分別在490nm和280nm處檢測糖與蛋白質(zhì)的峰形一致,表明鴨疫里默氏桿菌的莢膜多糖可能為糖蛋白。
　　 4.AF、BSY、HNDJ和MY株莢膜祖提物與雞抗鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價分別為1:8、1:1

6、6、1:8和1:8；經(jīng)初提純純化的莢膜物質(zhì)與雞抗鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價分別為1:1、1:2、1:4和1:2；經(jīng)離子交換和分子篩層析層析純化的莢膜多糖與雞抗鴨疫里默氏桿菌卵黃抗體在瓊擴(kuò)試驗中沒有出現(xiàn)沉淀線。用AF、BSY、HNDJ和MY株純化的莢膜多糖制作的礦物油乳劑免疫抗原分別在5和15日齡150ug/只的劑量免疫鴨,10天后用同型或異型菌株以10LD50劑量攻毒,AF株莢膜多糖免疫試驗鴨經(jīng)AF、BSY、HNDJ、MY株攻毒的