利用特定轉(zhuǎn)錄因子的mRNAs誘導(dǎo)小鼠體細胞重編成為多能狀態(tài)的研究.pdf

1、細胞分化是一個由少數(shù)特化細胞變?yōu)橐粋€完全分化的細胞類型的發(fā)育生物學(xué)過程。在多細胞生物的發(fā)育過程中，細胞分化使得生物由一個簡單的合子變?yōu)榫哂袕?fù)雜細胞類型和組織的系統(tǒng)。細胞分化過程是一個龐大的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括一些進化保守的分子過程，比如細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控分化相關(guān)基因的開關(guān)。盡管目前已有眾多關(guān)于細胞分化的調(diào)節(jié)機制的研究，但對于發(fā)育過程中細胞分化和特異化的機制尚不明確。為了解決之一問題，將已分化的細胞逆轉(zhuǎn)為多能性細胞，進而探討細胞的分化機

2、制就顯得尤為必要。
　　長時間以來，大部分學(xué)者認為細胞在分化過程中會失去不再需要的染色體或永久可滅活的基因，因此這些分化的體細胞命運無法重新編程。但是，細胞融合、體細胞核移植等實驗方法以及提取的所有細胞表明細胞的命運可以被逆轉(zhuǎn)并具有胚胎時期的特性，這暗示可溶性的反式作用因子在細胞中的存在，且可以賦予細胞從一個狀態(tài)轉(zhuǎn)變到另一個狀態(tài)的能力，通過發(fā)現(xiàn)和識別，這些因子被認定主導(dǎo)細胞特化和分化作用。這就表明在細胞分化過程中起重要作用的是可逆

3、的表觀遺傳變化，而非不可逆的基因變化。對基因重編程的不同理解為進一步探索在發(fā)育過程中細胞分化機制提供了新的方法和途徑。
　　目前利用體細胞重編程產(chǎn)生多能性細胞已取得很大成就，為進一步了解分化和去分化機制提供幫助，并在科學(xué)和醫(yī)學(xué)上領(lǐng)域能夠取代ES細胞以克服非倫理限制。此外，細胞重編程獲得的多能性細胞在醫(yī)療過程避免了免疫排斥的風(fēng)險，因為它來自于患者自身的細胞。而且，它能夠參與到組織工程、再生醫(yī)學(xué)細胞替代療法和藥物開發(fā)。
　　目前

4、通過體細胞核移入卵母細胞(SCNT)以及體細胞和多能性細胞進行細胞融合的方法能夠使細胞進行重編程而具有多能性。最近通過病毒介導(dǎo)特定轉(zhuǎn)錄因子(TFs)異位表達也具有同樣的功效。自此，由于病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在操作過程中的危險，以及轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的方法因DNA序列集成的限制可導(dǎo)致原癌基因表達導(dǎo)致惡性腫瘤和不良后果，所以該方法一直在不斷的改進。盡管把以非整合DNA為基礎(chǔ)的方法如:腺病毒，仙臺病毒或空病毒法作為質(zhì)粒、小環(huán)狀和非整合型附著載體的使用，DNA

5、的集成問題還是難以避免。故而，通過DNA轉(zhuǎn)染的方式讓相關(guān)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子在細胞中表達使得體外多能性的誘導(dǎo)成為可能。但是，這一方法仍然面臨眾多問題:成本高，效率低以及無法完全了解轉(zhuǎn)入細胞中蛋白質(zhì)的具體功能。而且，在非整合重編程獲得多能性細胞的過程中發(fā)現(xiàn)過表達和microRNAs轉(zhuǎn)染與多能性有關(guān)聯(lián)，但是具體機制尚不明確。
　　最近，科學(xué)家使用一種更加安全的重編程方法:通過導(dǎo)入編碼重編程因子的mRNA分子進入體細胞（mRNA介導(dǎo)的基因傳

6、遞）。這種方法在造血干細胞、充質(zhì)基質(zhì)細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞和來源于神經(jīng)元中的星形膠質(zhì)細胞中使用能夠高效的促進蛋白表達;并且成纖維細胞和星形膠質(zhì)細胞被重編程為心肌細胞。目前這項技術(shù)已經(jīng)證實，在人類體細胞成編程產(chǎn)生多能性性細胞，在轉(zhuǎn)染的體細胞多能性基因被成功激活。依賴相關(guān)因子易位表達的重編程與主要的基因，表觀遺傳修飾相結(jié)合能夠克服重編程過程中的轉(zhuǎn)錄障礙。
　　鑒于利用重編程因子mRNA來誘導(dǎo)小鼠的多能性的相關(guān)報道較少，我們在使用m

7、RNA轉(zhuǎn)染方法的基礎(chǔ)上，旨在將小鼠成纖維細胞去分化或重編程，逆向回到其多能性特性細胞的發(fā)育階段。為了實現(xiàn)這一目標成果，首先我們克隆與多能性相關(guān)的基因或因子的全序列，插入T7啟動子下游，構(gòu)建真核表達載體。其次，包含因子的新型重組載體用于體外合成mRNA，轉(zhuǎn)染至受體成纖維細胞中，目的是重編程具有胚胎干細胞特性，通過特異的形態(tài)學(xué)、分子和功能分析檢測這些重編程獲得的細胞的特性。最后，探索重編程機制，通過在重編程過程中跟蹤其表達和啟動子甲基化變化

8、，我們檢測了一些多能性標記的遺傳和表觀遺傳變化以及表觀遺傳分子的影響。本研究為更好的理解重編程過程調(diào)節(jié)提供基礎(chǔ)，并且有助于發(fā)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育機制。
　　本研究結(jié)果包括以下幾點:
　　1.根據(jù)Gnen Bank公布的四個多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc，和K1f4(OSCK)的序列并克隆。從鼠的睪丸、小腸和結(jié)腸等組織中反轉(zhuǎn)錄(RTPCR)獲得OSCK的開放閱讀框或編碼區(qū)(CDS)。結(jié)果顯示，OSCK的CDS長度分別為

9、1059 bp，960 bp，1320 bp和1452bp。NCBI BLAST測序結(jié)果顯示，每一個基因都與屬的參考序列具有高序列同源，Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4分別為100％，100％，100％和99％。這些說明克隆的四個基因序列正確。
　　2.通過體外克隆真核表達載體下游到T7啟動子的開放閱讀框(ORF)來構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄模板并且在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中在5'端加帽子，在3'端加poly(A)尾巴。合成的mRNA通過陽離

10、子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細胞中，轉(zhuǎn)染第二天RT-PCR檢測到mRNA的高表達。間接免疫熒光染色表明該mRNA表達的蛋白在細胞核中表達。
　　3.通過流式細胞(FACS)分選轉(zhuǎn)染編碼GFP的mRNA的細胞，我們優(yōu)化的轉(zhuǎn)染體系為每1×105 MEF最適mRNA量為1ug，并且檢測出持續(xù)幾天均具有高表達，隨后由于mRNA和蛋白的降解而降低，結(jié)果說明了需要幾次重復(fù)轉(zhuǎn)染mRNA來保持蛋白的長時間高水平表達，這對于細胞重編程來說是必需的。

11、經(jīng)過五次連續(xù)轉(zhuǎn)染，觀察到成纖維細胞的間充質(zhì)表面出現(xiàn)細胞形態(tài)變化，呈現(xiàn)緊湊的上皮細胞的形狀，且在轉(zhuǎn)染期間不斷增加直到在重編程的第8天出現(xiàn)類似克隆的結(jié)構(gòu)，隨著時間變化，在第15天，克隆數(shù)量達到100-130個，尺寸上逐漸增大，呈現(xiàn)明顯的邊緣，具有高的核質(zhì)比。新生的類ES克隆呈現(xiàn)AKP陽性，通過RT-PCR或免疫染色技術(shù)顯示表達ES細胞特異性標記基因。新轉(zhuǎn)變的細胞同樣也顯示出與ESC相近的啟動子甲基化模式以及體內(nèi)和體外分化為三個主要發(fā)育的胚層

12、的能力，免疫染色顯示胚層特異性標記物顯示陽性;βⅢ微管蛋白（外胚層），平滑肌肌動蛋白(SMA)（中胚層）以及Sox17(內(nèi)胚層)。在體內(nèi)，畸胎瘤形成包含所有三個胚層的組織，包括軟骨、肌肉、脂肪（中胚層），色素上皮組織（外胚層）以及上皮組織（內(nèi)胚層）。因此，當轉(zhuǎn)染鼠特異合成mRNA，鼠多能性基因的激活和誘導(dǎo)的多能性干細胞的產(chǎn)生可以通過一個安全的方式獲得。
　　4.在此期間，通過檢測的一些多能性標志物的表達水平與啟動子甲基化狀態(tài)，本研

13、究檢測了在重編程期過程中相關(guān)基因的表達變化。上皮基因如E-鈣粘蛋白(CDH1)持續(xù)上調(diào)伴隨，間葉細胞基因如Snail和Thy1持續(xù)下調(diào)，并伴隨間質(zhì)細胞向上皮細胞的過渡過程中的形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染多能性基因的表達:在轉(zhuǎn)染期間（第一個6天）表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子(OSCK)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染停止后這些因子有一段時間的下調(diào)。我們的研究揭示了當大部分轉(zhuǎn)錄因子降解過程中，在第12天開始產(chǎn)生了第二次的基因上調(diào)，原因可能是由于這些因子的內(nèi)源性基因被激活。一旦在實