大腸癌細(xì)胞系SW620的腫瘤干細(xì)胞研究及原代大腸腫瘤的靶向性促凋亡基因治療研究.pdf

1、第一部分：研究表明，CD133在許多腫瘤(包括大腸癌腫瘤)中都被證實為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記，O’Brien和Ricci等人通過原代大腸癌的腫瘤研究證實大腸癌的腫瘤起始細(xì)胞為CD133陽性標(biāo)記群體，CD133陽性細(xì)胞最終決定了腫瘤的生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥。然而，通過使用LacZ基因敲除小鼠模型，Shmelkov等人對這種被日益接受的觀點提出了質(zhì)疑。Shmelkov等人主要提出兩個不同觀點：首先，他們認(rèn)為CD133廣泛表達(dá)于人或老鼠的大腸癌細(xì)胞

2、群體內(nèi)，而非僅限于一小部分所謂的干細(xì)胞群體內(nèi)。第二，CD133陰性腫瘤細(xì)胞也能在裸鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤，并且其具有更加強(qiáng)大的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力?；谝陨蟽蓚€相互背離的觀點，我們認(rèn)為，CD133在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與干細(xì)胞特性之間可能存在定量關(guān)系而非絕對單一的定性關(guān)系。定量分析CD133在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)也許會更好的揭示CD133與腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系。為了證實這種關(guān)系的存在，我們選擇大腸癌細(xì)胞系SW620進(jìn)行培養(yǎng)并用免疫磁珠分選的技術(shù)方法將其分為CD

3、133高表達(dá)(CD133Hi)，CD133中表達(dá)(CD133Mid)及CD133低表達(dá)(CD133Low)三組并進(jìn)行體內(nèi)接種及體外培養(yǎng)研究。研究結(jié)果顯示CD133高表達(dá)組的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的生長活性更加強(qiáng)大旺盛，證實腫瘤干細(xì)胞(腫瘤起始細(xì)胞)與CD133的表達(dá)強(qiáng)度存在正相關(guān)關(guān)系。CD133的高表達(dá)也許可以作為篩選腫瘤干細(xì)胞的指標(biāo)之一。
　　 第二部分：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necr

4、osis factor，TNF)家族成員，很多研究發(fā)現(xiàn)體外實驗及靜脈注射重組TRAIL蛋白能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖，提高荷瘤動物的生存率而不引起毒性反應(yīng)。同時，其對體內(nèi)正常組織卻不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生微弱的毒副作用。之后很多研究者以腺病毒作為載體，將TRAIL基因直接轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這種基因治療方法同樣可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長。目前認(rèn)為TRAIL誘導(dǎo)凋亡機(jī)制主要是與死亡受體DR4或DR5結(jié)合并活化死亡受體，激活Cas

5、pase-8引發(fā)和傳導(dǎo)凋亡信號，再進(jìn)一步激活Caspase-3蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。但已有文獻(xiàn)報導(dǎo)，一些細(xì)胞系對單獨TRAIL的治療已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，而與化療藥聯(lián)合應(yīng)用可以一定程度地降低耐藥性的發(fā)生。為了觀察靶向基因藥物TRAIL與化療藥聯(lián)合應(yīng)用提高腫瘤細(xì)胞敏感性，降低耐藥性的的可行性，本研究探討了重組腺病毒載體介導(dǎo)的TRAIL基因制劑(Ad/gTRAIL)與化療藥物Taxol、5-Fu等聯(lián)合應(yīng)用對原代大腸癌細(xì)胞的作用，

6、同時還探討了該種治療模式在原代大腸癌裸鼠荷瘤模型中的聯(lián)合治療效應(yīng)。通過檢測不同處理組內(nèi)腫瘤細(xì)胞TRAIL，DR4，Caspase-3，Caspase-8及凋亡發(fā)生率來驗證可能的TRAIL抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制。本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)Ad/TRAIL藥物治療后單藥組及聯(lián)合用藥組腫瘤細(xì)胞內(nèi)TRAIL蛋白相對于其他對照組表達(dá)增高從而發(fā)揮抗腫瘤作用。組化結(jié)果顯示各處理組腫瘤組織中處于TRAIL凋亡通路最下游的Caspase-3均有表達(dá)，而以含TR

7、AIL藥物組癌組織中Caspase-3表達(dá)明顯增高，反映出在相應(yīng)藥物處理作用下，癌細(xì)胞Caspase凋亡通路受到激活，促凋亡產(chǎn)物得以明顯提升。凋亡染色結(jié)果說明，通過瘤內(nèi)注射Ad/TRAIL時，致使Ad/TRAIL接觸到的腫瘤腺體發(fā)生Ad/TRAIL感染及旁觀者效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤腺體的徹底崩解，使腫瘤得到有效殺傷。通過裸鼠體內(nèi)瘤體接種實驗及生存率曲線分析顯示，藥物處理組的裸鼠平均瘤體生長較慢，裸鼠生存率較長，從體外實驗角度支持TRAIL藥物的抗