梅毒螺旋體膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971通過(guò)TLR2途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子.pdf

1、目的：探討梅毒螺旋體（Treponema pallidum, Tp）膜脂蛋白 Tp0663、Tp0821、Tp0971能否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子（CKs）IL-6和IL-1β；通過(guò)觀察 TLR2抗體、CD14抗體、NF-κB特異抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)對(duì)三種膜脂蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CKs的影響，研究這些膜脂蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生前炎癥CKs是否與TLR2、CD14及NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
　　方法：①通過(guò)G

2、enbank獲取選Tp0663、Tp0821和Tp0971的基因序列，以Tp Nichols株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，將其亞克隆至原核表達(dá)載體 pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28a(+)/Tp0663、pET28a(+)/Tp0821和pET28a(+)/Tp0971，經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli Rosseta中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western blot

3、分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；Detoxi-Gel?內(nèi)毒素去除膠去除重組蛋白中的內(nèi)毒素,經(jīng)鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素含量。②佛波酯（PMA）誘導(dǎo)人單核細(xì)胞THP-1轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，用Tp0663、Tp0821和Tp0971重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞，ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)誘生其前炎癥細(xì)胞因子 IL-6和IL-1β的情況；用TLR2抗體、CD14抗體和PDTC預(yù)處理巨噬細(xì)胞后，用Tp0663、Tp082

4、1和p0971重組蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞，ELISA分析TLR2抗體、CD14抗體和PDTC對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β的影響。
　　結(jié)果：構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)插入片段為目的基因，測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組表達(dá)菌分別表達(dá)了一相對(duì)分子量（Mr）約為34kDa（Tp0663）和36 kDa（Tp0821），29 kDa（Tp0971）的重組

5、蛋白，目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性和包涵體形式存在，經(jīng)Ni-NTA親和純化后，純度在95％以上，Western blot結(jié)果顯示其與目的蛋白大小相符；內(nèi)毒素去除膠處理重組蛋白，經(jīng)鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素小于0.04EU/mL；THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA刺激轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，不同濃度的重組蛋白（0.5μg/ml～10μg/ml）能明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β；當(dāng)重組蛋白濃度高于3μg/ml（Tp0663）和5μg/ml（Tp0821和Tp0

6、971）時(shí)，IL-6和IL-1β產(chǎn)生的量無(wú)明顯增加。TLR2抗體處理后，Tp0663, Tp0821和Tp0971誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生量分別降至66.0%、64.0%和60.0%，IL-1β的產(chǎn)生量分別降至63.0%、62.0%和62.0%；經(jīng)CD14抗體處理后, IL-6的產(chǎn)生量分別降至71.0%、73.0%和69.0%， IL-1β的產(chǎn)生量分別降至69.0%、70.0%和66.0%,經(jīng)TLR2和CD14抗體聯(lián)合處理后 IL-6的產(chǎn)生量

7、分別降至54.0%、55.0%和56.0%，IL-1β的產(chǎn)生量分別降至51.0%、50.0%和52.0%，NF-κB特異性抑制劑PDTC處理后 IL-6和IL-1β的產(chǎn)生量分別降至20%以下，各處理組與對(duì)照組(同型抗體)比較(P<0.05)有明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. Tp0663、Tp0821和Tp0971重組蛋白能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥 CKs IL-6和IL-1β；
　　2. Tp0663、Tp0821和T