GRP78-CHOP信號通路在驚厥持續(xù)狀態(tài)幼年大鼠海馬中的作用及依達拉奉對其的影響.pdf

1、目的： 1.觀察驚厥持續(xù)狀態(tài)(SC)幼年大鼠海馬葡萄糖調節(jié)蛋白78/免疫球蛋白重鏈結合蛋白Bip(GRP78/Bip)、前凋亡因子(CHOP/GADD153)、caspase-3及TUNEL陽性細胞表達的變化，探討其相關性；并觀察依達拉奉預處理后三者的變化； 2.探討GRP78/CHOP信號途徑在驚厥性腦損傷中的作用及依達拉奉對其的影響。 方法：雄性SD幼年大鼠208只分為正常對照組(NC組)、驚厥持續(xù)狀態(tài)組(S

2、C組)、依達拉奉組(EDA組)和生理鹽水對照組(NS組)四大組；其中SC組、EDA組和NS組又均隨機分為5組，分別于驚厥后2h、12h、24h、48h和72h處死。采用氯化鋰.匹魯卡品法制作驚厥持續(xù)狀態(tài)模型：幼年大鼠按127mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰，18h后按1mg/kg劑量腹腔注射硫酸阿托品，30min后按100mg/kg劑量腹腔注射匹魯卡品；觀察大鼠行為學變化，記錄各組大鼠的驚厥率、驚厥潛伏期、驚厥程度分級、驚止時間及死亡情況。

3、選擇驚厥發(fā)作達到Ⅳ以上，且終止驚厥發(fā)作后狀態(tài)良好的大鼠為合格SC大鼠模型。EDA組在大鼠造模前三天予EDA3mg/kg腹腔注射，每天注射一次，連續(xù)3天；NS組以等量生理鹽水取代EDA。大鼠于驚厥后各時間點處死：光鏡、電鏡和TUNEL法檢測觀察大鼠海馬病理學改變及細胞凋亡情況；免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)GRP78/Bip和CHOP/GADD153蛋白表達動態(tài)變化；RT-PCR技術檢測海馬GRP78/Bip、CHOP/GADD15

4、3和caspase-3mRNA表達的動態(tài)變化。 結果： 1.驚厥持續(xù)狀態(tài)模型的建立：注射匹魯卡品后，有14只(14/195)大鼠未成功誘發(fā)驚厥，27只(27/181)出現(xiàn)Ⅳ發(fā)作，其余大鼠154(154/181)均誘導出Ⅴ級驚厥發(fā)作。造模過程中死亡大鼠14只，其中2只(2/181)于驚厥后12h死亡；2只(2/181)于驚厥后24h死亡；5只(5/181)于48h死亡；3只(3/181)死于驚厥后72h；其死亡高峰位于驚厥

5、后48h，總死亡率為6.73％。 2.HE染色：NC組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及顳葉皮層錐體細胞層次清晰，排列整齊，神經(jīng)元輪廓清晰，胞核大而圓。SC組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性及丟失，以海馬CA1、CA3區(qū)最顯著，驚厥后2h少量神經(jīng)元腫脹；12h排列欠整齊，受累數(shù)增加；24h胞漿胞核空泡化；48h細胞不規(guī)則，見紅色神經(jīng)元及空穴；72h有減輕。NS組與SC組表現(xiàn)相似。EDA組各時間點總體比SC組減輕。 3.電鏡：NC組

6、大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結構清晰，胞膜及核膜完整光滑，核染色質分布均勻，胞漿內線粒體，高爾基體和內質網(wǎng)(ER)等細胞器豐富。SC組表現(xiàn)為：驚厥后2h神經(jīng)元毛細血管周圍水腫，12h部分ER輕度擴張，個別線粒體輕度腫脹：24細胞間隙擴張，部分ER和線粒體擴張；48h以后ER擴張較前有所減輕，線粒體腫脹有加重。NS組與SC組表現(xiàn)相似。EDA組各時間點改變均較SC組減輕。 4.TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡結果：SC組海馬CA1、CA3區(qū)TU

7、NEL陽性細胞表達均于驚厥后2h少量增加，48h達高峰，之后下降；但均明顯高于NC組(P＜0.05或P＜0.01)，與NS組比較無明顯差異(P＞0.05)。EDA組12h～72h時間點TUNEL陽性細胞較SC組和NS組均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；但仍高于NC組(P＜0.01)。 5.免疫組化檢測結果： (1)GRP78/Bip蛋白免疫組化檢測結果：正常海馬CA1、CA3區(qū)GRP78/Bip蛋白少量表達，SC

8、后2h開始增加，24h達高峰，之后下降。EDA組24h和48h時間點GRP78/Bip蛋白表達較SC組和NS組均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。 (2)CHOP/GADD153蛋白免疫組化檢測結果：正常海馬CA1、CA3區(qū)CHOP/GADDD153蛋白少量表達，SC后2h表達開始增加，24h達高峰，72h明顯下降。EDA組各時間點CHOP/GADDD153蛋白表達較SC組和NS組均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；

9、但仍高于NC組(P＜0.01)。 6.RT-PCR檢測結果： (1)GRP78/BipmRNA表達結果：SC組海馬GRP78/BipmRNA表達于驚厥后2h開始少量增加，24h達高峰，之后緩慢下降；但均明顯高于NC組(P＜0.05或P＜0.01)，與NS組比較無明顯差異(P＞0.05)。EDA組2h和24h時間點海馬GRP78/BipmRNA表達較SC組和NS組均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。 (2)C

10、HOP/GADD153mRNA表達結果：生理狀態(tài)下，海馬CHOP/GADDD153mRNA少量表達，驚厥后2h表達迅速增加，12h達高峰，24h開始下降：但均明顯高于NC組(P＜0.05或P＜0.01)，與NS組比較無明顯差異(P＞0.05)。EDA組2h，12h，48h時間點海馬CHOP/GADDD153mRNA表達較SC組和NS組均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01=；但仍高于NC組(P＜0.01)。 (3)caspase

11、-3mRNA表達結果：SC組海馬caspase-3mRNA于驚厥后2h開始表達，48h達高峰，之后緩慢下降；但均明顯高于NC組(P＜0.05或P＜0.01)，與NS組比較無明顯差異(P＞0.05)。EDA組2h，24h，48h和72h時間點海馬caspase-3mRNA表達較SC組和NS組均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01=；但仍高于NC組(P＜0.01)。 7.相關性分析：大鼠海馬GRP78/BipmRNA與CHOP/GA

12、DD153mRNA、caspase-3mRNA呈正相關(Y=0.433，0.449，P＜0.01=。海馬CA1區(qū)GRP78/Bip蛋白與CA1區(qū)CHOP/GADD153蛋白、CA1區(qū)TUNEL陽性細胞、caspase-3mRNA呈正相關(γ=0.612，0.660，0.576，P＜0.01=。海馬CA3區(qū)GRP78/Bip蛋白與CA3區(qū)CHOP/GADD153蛋白、CA3區(qū)TUNEL陽性細胞、caspase-3mRNA呈正相關(γ=0.

13、641，0.576，0.501，P＜0.01=。海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞與CA1區(qū)CHOP/GADD153蛋白、CHOP/GADD153mRNA、caspase-3mRNA呈正相關(γ=0.691，0.585，0.776，P＜0.01=。海馬CA3區(qū)TUNEL陽性細胞與CA3區(qū)CHOP/GADD153蛋白、CHOP/GADD153mRNA、caspase-3mRNA呈正相關(γ=0.602，0.339，0.760，P＜0.01=。

14、 結論： 1.SC后幼年大鼠海馬存在不同程度的神經(jīng)元丟失、凋亡，提示SC可致海馬不同程度損傷。 2.SC后早期幼年大鼠海馬GRP78/Bip與CHOP/GADD153mRNA和蛋白表達均增高，提示SC后幼年大鼠海馬內可能發(fā)生ERS，且GRP78/CHOP信號通路可能被激活。 3.SC后早期上述兩指標表達與caspase-3mRNA增高及海馬神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)正相關；提示GRP78/CHOP信號通路可能通過激