HGF調控TGF-β1誘導的骨骼肌細胞纖維化轉型的作用及機制.pdf

1、目的：
　　 建立一種高效的骨骼肌細胞分離培養(yǎng)的方法，并在此基礎上觀察轉化生長因子-β1(transforminggrowthfactorbeta-1，TGF-β1)誘導的骨骼肌細胞纖維化轉型的作用，探討肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)調控TGF-β1誘導骨骼肌細胞纖維化轉型的作用及機制，為臨床治療失神經(jīng)喉肌纖維化提供一種新策略和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、骨骼肌細胞

2、的分離和培養(yǎng)
　　 實驗組采用經(jīng)腹主動脈Ⅱ型膠原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL/6小鼠趾長伸肌，D-Hanks液沖洗后移入試管以Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合振蕩消化；對照組小鼠處死后直接取趾長伸肌，D-Hanks液沖洗后用Ⅰ型膠原酶振蕩消化，以廣口吸管研磨肌腹使肌細胞徹底松散。顯微鏡下對兩種分離方法獲得的骨骼肌細胞進行計數(shù)，各組均選取完整存活的肌細胞進行培養(yǎng)，不同時間點觀察存活率。
　　 2、TGF-β1誘導骨骼肌細胞

3、纖維化轉型的作用及機制
　　 C2C12細胞以分化培養(yǎng)基誘導融合為肌管，分化培養(yǎng)72小時后更換培養(yǎng)液為不含血清的DMEM，分別給予不同濃度TGF-β1(Ong/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，5.0ng/ml)進行干預，12h后實時熒光定量PCR檢測各組CTGF和α-SMA在轉錄水平的變化，Westernblot檢測CTGF和α-SMA在蛋白水平表達變化。
　　 骨骼肌細胞分離后培養(yǎng)24小時，選取存活且狀態(tài)良好的肌

4、細胞隨機分成實驗組和對照組，實驗組給予TGF-β1(0.5ng/ml)進行干預。12小時后實時熒光定量PCR檢測各組CTGFmRNA和α-SMAmRNA的變化，Westernblot檢測CTGF和α-SMA蛋白表達變化。
　　 3、HGF調控TGF-β1誘導骨骼肌細胞纖維化轉型的作用及機制
　　 將分離培養(yǎng)的骨骼肌細胞隨機分成三組：①空白對照組②TGF-β1(0.5ng/ml)誘導組(HGF未干預組)③HGF(4ng/m

5、l)和TGF-β1(0.5ng/ml)共同干預組，12小時后實時熒光定量RT-PCR檢測各組CTGFmRNA和α-SMAmRNA的變化，間接免疫熒光法和Westernblot檢測CTGF和α-SMA蛋白分布和表達水平。
　　 4、統(tǒng)計學方法
　　 所有實驗結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學處理。先進行各組方差齊性檢驗，符合方差齊性條件，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)

6、和t檢驗；不符合方差齊性條件，采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、兩種分離方法獲得的骨骼肌細胞的數(shù)量、生存率
　　 ×5物鏡下平均每個視野灌注法獲得的肌細胞數(shù)為(32.17±2.09)根，研磨法獲得的肌細胞數(shù)為(10.58±1.15)根，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。24h灌注法肌細胞存活率是研磨法的3.20倍，48h灌注法肌細胞存活率是研磨法的2.76倍，72h灌注法肌

7、細胞存活率是研磨法的2.75倍，各時間點生存率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但灌注法操作時間比研磨法長，且膠原酶消耗大，實驗成本高。
　　 2、TGF-β1誘導肌管纖維化轉型作用及機制
　　 不同濃度TGF-β1干預下，肌管CTGFmRNA表達量較空白對照組均增高，在1ng/ml濃度時表達量最高為空白對照組的16.03倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；不同濃度TGF-β1干預下肌管α-SMAmRNA表達量較空白

8、對照組均增高，在1ng/ml濃度時表達量最高是空白對照組的4.52倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。肌管CTGF蛋白表達量較空白對照組均增高，在1ng/ml濃度時表達量最高是空白對照組的1.88倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；肌管α-SMA蛋白表達量較空白對照組均增高，在1ng/ml濃度時表達量最高是空白對照組的1.59倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、TGF-β1誘導骨骼肌細胞纖維化轉型的作用及機制<

9、br>　　 TGF-β1誘導下骨骼肌細胞CTGFmRNA的表達是空白對照組9.55倍，α-SMAmRNA的表達是空白對照組26.82倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TGF-β1誘導下骨骼肌細胞CTGF蛋白的表達是空白對照組3.63倍，α-SMA蛋白的表達是空白對照組3.38倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、HGF調控TGF-β1誘導的骨骼肌細胞纖維化轉型的作用及機制
　　 HGF干預后CTGF和α

10、-SMAmRNA的表達量明顯下降，TGF-β1誘導組(HGF未干預組)CTGFmRNA表達量是HGF干預組6.57倍，TGF-β1誘導組(HGF未干預組)α-SMAmRNA表達量是HGF干預組2.64倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HGF干預后CTGF和α-SMA蛋白表達量也下降，TGF-β1誘導組(HGF未干預組)CTGF蛋白表達量是HGF干預組2.21倍，TGF-β1誘導組(HGF未干預組)α-SMA蛋白表達量是HGF干預組1

11、.49倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組骨骼肌細胞CTGF和α-SMA免疫熒光均檢測到陽性信號，以TGF-β1誘導組(HGF未干預組)信號最強，HGF干預后信號較TGF-β1誘導組(HGF未干預組)減弱。
　　 實驗結論：
　　 1、采用膠原灌注法獲得骨骼肌細胞數(shù)量多，存活率高，比原有方法更具優(yōu)勢。但此法操作時間長，流程較繁瑣，需要長期反復實踐摸索。
　　 2、TGF-β1可促進骨骼肌細胞和肌管CTGF、