滋補(bǔ)脾陰方藥保護(hù)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是骨科領(lǐng)域致殘率、死亡率最高的創(chuàng)傷之一，是交通、工礦事故及運(yùn)動(dòng)意外中常見(jiàn)的損傷。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem eell，NSC)移植成為SCI截癱治療的研究焦點(diǎn)之一。但最近國(guó)外有研究表明，將體外懸浮方式培養(yǎng)的大鼠胚胎NSC移植入成鼠損傷脊髓后，移植細(xì)胞只能分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞；并認(rèn)為這是由于宿主損傷脊髓內(nèi)環(huán)境不支持NSC向神經(jīng)元祖細(xì)胞分化所致，但損傷脊髓卻允許譜系限制性

2、的神經(jīng)元前體細(xì)胞(neuronal-restricted precursor cell，NRP)和膠質(zhì)前體細(xì)胞(glial-restricted precursor cell，GRP)的存活及分化。貼壁方式培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞主要由NRP/GRP組成，于是貼壁培養(yǎng)手段重新受到國(guó)外一些學(xué)者的重視。然而，究竟何種類型細(xì)胞更適于SCI移植治療，目前尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)比較了神經(jīng)前體細(xì)胞在懸浮與貼壁兩種培養(yǎng)方式下的生長(zhǎng)特性，旨在為選擇合適類型的細(xì)胞移

3、植治療SCI提供參考依據(jù)。 SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷為不可逆性改變，故治療主要針對(duì)繼發(fā)性損傷。研究已發(fā)現(xiàn)由氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)脊髓繼發(fā)性損傷起主要作用。脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度對(duì)移植細(xì)胞的命運(yùn)影響也很大。祖國(guó)醫(yī)學(xué)將SCI所致的截癱，歸屬于體惰和痿證的范疇，治療上以活血化瘀、疏通督脈、通經(jīng)活絡(luò)、益氣補(bǔ)血、補(bǔ)腎填精為主。腎主骨生精髓，精髓傷則腎傷，精血互生，且腎所生精髓需靠后天之本、氣血化生之源的脾胃源源不

4、斷地充盈。滋補(bǔ)脾陰方藥(nourishing piyin remedy)具有益氣補(bǔ)血、補(bǔ)腎填精、充盈脾胃等功效，可以改善脊髓細(xì)胞線粒體ATP酶活性，緩解脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)：并能通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂代謝，增強(qiáng)線粒體膜抗氧化能力以保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)探討了滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)NRP/GRP細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，旨在為進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用含藥血清和NRP/GRP細(xì)胞移植治療SCI奠定基礎(chǔ)。目前在SCI模型建立方面，國(guó)內(nèi)外以Allen裝置或NY

5、U裝置打擊的輕度挫傷模型(致傷力2.5g×10cm)應(yīng)用較為廣泛。中度挫傷模型(致傷力5g×10cm)涉及很少。輕度脊髓挫傷后，早期的組織缺失及后期的繼發(fā)損傷均較輕。而中度挫傷在形態(tài)學(xué)及病理生理學(xué)上的損傷均較重，移植物的生存環(huán)境更差，其中過(guò)氧化損傷作用尤為明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)利用滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清的抗過(guò)氧化損傷作用，預(yù)先保護(hù)移植NRP/GRP細(xì)胞，以探討二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)脊髓中度挫傷的神經(jīng)修復(fù)作用。 實(shí)驗(yàn)一胚胎脊髓源神經(jīng)前體細(xì)胞懸浮

6、與貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性研究目的：比較胚胎脊髓源神經(jīng)前體細(xì)胞在懸浮與貼壁兩種培養(yǎng)方式下韻生長(zhǎng)特性，為選擇合適類型的細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供參考依據(jù)。 方法：取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓組織，按懸浮和貼壁兩種方式分組培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)變化。描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)72小時(shí)后行BrdU增殖率檢測(cè)，Nestin、PSA-NCAM、A<,2>B<,5>抗體熒光鑒定和流式細(xì)胞檢測(cè)。部分細(xì)胞行胎牛血清誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。

7、結(jié)果：懸浮組細(xì)胞多以細(xì)胞球形態(tài)生長(zhǎng)，貼壁組細(xì)胞呈散在生長(zhǎng)。懸浮組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更旺盛。培養(yǎng)72小時(shí)懸浮和貼壁組細(xì)胞的Brdu增殖率分別為28.50﹪±4.67﹪和9.11﹪±1.82﹪(P<0.05)；兩組細(xì)胞Nestin、NCAM、A<,2>B<,5>抗體熒光反應(yīng)均呈陽(yáng)性：懸浮組各抗體表達(dá)率相對(duì)較均勻，而貼壁組以NCAM、A<,2>B<,5>抗體表達(dá)為主(>80﹪)。兩組細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)，均能逐漸分化成熟，表達(dá)NF-200，GFAP，

8、Gal-C熒光抗體。 結(jié)論：懸浮組細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于貼壁組。早期懸浮培養(yǎng)細(xì)胞以神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞為主；而貼壁培養(yǎng)細(xì)胞則以譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞為主(>80﹪)。懸浮及貼壁組細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)，均可分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。目的：探討滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)治療脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。 方法：取貼壁培養(yǎng)3天的譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞，分正常組、損傷

9、組、空白血清干預(yù)組、中藥血清干預(yù)組、空白血清干預(yù)后損傷組和中藥血清干預(yù)后損傷組，建立過(guò)氧化氫損傷模型。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：利用MTT法計(jì)算細(xì)胞存活率；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活力；并行Hoechst33258熒光染色，觀察細(xì)胞熒光分布和凋亡情況。 結(jié)果：過(guò)氧化氫損傷可造成細(xì)胞存活率顯著降低：細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增加，SOD活力明顯下降；并加快細(xì)胞凋亡。經(jīng)含藥血清干預(yù)后的細(xì)胞在同樣損傷條件下，細(xì)胞存活率提高；并避免了細(xì)胞內(nèi)MD

10、A含量的過(guò)度增加，和SOD活力的過(guò)度下降；還能減輕細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷起一定程度的保護(hù)作用；并能改善過(guò)氧化損傷后細(xì)胞的存活率和存活狀態(tài)。目的：探討譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞(NRP/GRP)移植對(duì)脊髓中度挫傷的神經(jīng)修復(fù)作用，及滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)移植細(xì)胞在體內(nèi)存活、遷移和分化的影響。 方法：成年雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、損傷對(duì)照組(B組)、DME

11、M培養(yǎng)基移植組(C組)、NRP/GRP移植組(D組)、NRP/GRP與空白血清共移植組(E組)，和NRP/GRP與中藥血清共移植組(F組)。利用自制電控打擊器制作動(dòng)物模型。通過(guò)BBB評(píng)分、皮層體感誘發(fā)電位測(cè)定，評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能恢復(fù)情況。術(shù)后4天、2周和5周時(shí)，分別觀察BrdU標(biāo)記的移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化情況。 結(jié)果：F組在術(shù)后2周，BBB評(píng)分明顯恢復(fù)。D組、E組在術(shù)后4周，BBB評(píng)分明顯恢復(fù)。術(shù)后5周F組CSEP波形

12、略恢復(fù)。術(shù)后4天、2周和5周時(shí)，細(xì)胞移植三組分別可見(jiàn)較多的BrdU標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)存活、遷移和分化，均以F組最明顯。結(jié)論：譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞移植后，可以在體內(nèi)存活、遷移并分化成熟，促進(jìn)大鼠脊髓中度挫傷后神經(jīng)纖維的修復(fù)與再生。滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清可以改善損傷脊髓內(nèi)環(huán)境，有利于移植細(xì)胞的存活、遷移及分化。二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)滋補(bǔ)脾陰方藥保護(hù)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的研究，獲得了以下成果： 1

13、．早期懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是以神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞為主的混合物；而貼壁培養(yǎng)細(xì)胞則以譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞為主(>80﹪)。懸浮及貼壁培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)，均可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 2．滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清通過(guò)避免細(xì)胞過(guò)氧化損傷后SOD過(guò)度下降，減少損傷后MDA生成，對(duì)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷起一定程度的保護(hù)作用。 3．譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞在脊髓中度挫傷后即刻移植，可以在體內(nèi)存活、遷移并分化

14、為成熟的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)纖維的修復(fù)與再生；是治療脊髓損傷較有前景的細(xì)胞移植物。 4．滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清可以改善損傷脊髓的內(nèi)環(huán)境，減輕移植細(xì)胞的過(guò)氧化損傷反應(yīng)，有利于移植譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化。滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清與譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用治療脊髓損傷，具有協(xié)同效應(yīng)。 5．如何進(jìn)一步增強(qiáng)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血