RPL8基因修飾的DC疫苗抑制膠質瘤生長的研究.pdf

1、實驗目的：
　　 1構建RPL8基因的重組腺病毒載體和空載體腺病毒，獲得高滴度的腺病毒顆粒。
　　 2將RPL8腺病毒顆粒體外轉染小鼠樹突狀細胞(DC)，制成表達RPL8的DC疫苗。
　　 3采用MTT比色法檢測RPL8基因修飾的DC疫苗刺激同種T淋巴細胞對GL261膠質瘤細胞特異的殺傷率。
　　 4將RPL8基因修飾的DC疫苗注入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的抗腫瘤作用。
　　 實驗方法：

2、
　　 1大量培養(yǎng)膠質瘤細胞，按照總RNA試劑盒提取細胞RNA，以總RNA為模板，用RT-PCR方法克隆目的基因RPL8，與載體連接、酶切、插入，并轉移到pAdxsi腺病毒骨架載體上，包裝擴增成腺病毒顆粒。
　　 2用重組腺病毒(pAdxsi-EGFP-RPL8)及空病毒Ad-EGFP(作為陰性對照)以實驗室最佳的感染復數(shù)(MOI)150感染小鼠樹突狀細胞，于感染后24h、48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EG

3、FP)的表達情況，并應用RT-PCR方法檢測DC中有無RPL8 mRNA的表達。
　　 3重組RPL8的病毒顆粒(及空病毒)轉染DC，培養(yǎng)48h后與尼龍毛柱分離的小鼠脾臟T淋巴細胞按不同的比例混勻，繼續(xù)培養(yǎng)72h，分別以不同效靶比加入到GL261膠質瘤細胞中培養(yǎng)48h，酶標儀測定其OD值。
　　 4將RPL8基因修飾的DC疫苗注入荷瘤小鼠體內(nèi)，進行免疫治療的體內(nèi)實驗，觀察腫瘤的體積變化及小鼠的生存時間與瘤體組織的病理變化

4、。
　　 結果：
　　 1經(jīng)酶切及測序鑒定，成功構建了攜帶RPL8基因的重組腺病毒載體，并制備出高滴度(1.6×1010PFU/ml)的重組腺病毒和空載體腺病毒(1.0×1010PFU/ml)。
　　 2不同時間在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(EGFP)表達，并用RT-PCR的方法檢測出DC細胞中有RPL8mRNA的表達，得到預期309bp的條帶。
　　 3 RPL8基因修飾的DC疫苗體外殺傷GL26