分泌型TRAIL基因修飾人脂肪干細胞靶向腦膠質瘤治療的研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)膠質瘤（glioma）簡稱膠質瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。膠質瘤包括多種不同的腫瘤類型，各個類型的惡性程度也不相同，其中惡性程度最高的當屬多形性膠質母細胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM，WHO IV級）。由于該腫瘤細胞呈彌漫性或者浸潤性生長，手術難以徹底切除所有腫瘤組織，即使術后配合放療和化療，患者的預后依然不理想。據(jù)統(tǒng)計，GBM患者經(jīng)過治療后的平均生存時間為14.6個

2、月。因此，如何改善惡性膠質瘤患者的生存率及生存質量，這一直是醫(yī)學界面臨的難題。
　　上世紀90年代初，基因治療的熱潮曾為惡性膠質瘤的治療帶來一線曙光，其中以HSV-TK GCV系統(tǒng)為代表的基因治療雖然在動物試驗中都取得了良好的效果，但是臨床試驗都未取得預期的療效，這可能是由于病毒載體不穩(wěn)定，目的基因不能長期表達，自體免疫，靶向性問題和病毒載體無法追蹤浸潤瘤細胞所致。目前很多研究表明，骨髓間充質干細胞，人臍帶血干細胞，神經(jīng)干細胞等對

3、腫瘤都有趨化性。這種趨化性與腫瘤分泌的細胞因子和趨化因子有關，并且干細胞能透過破壞的血腦屏障，在腫瘤周圍高濃度聚集。這一特性已經(jīng)在各種體內和體外試驗中被證實。這一特性目前認為是將以間充質干細胞作為載體的酶/抗腫瘤前藥基因組合靶向治療腫瘤的理想治療策略之一。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）目前也證明具有靶向腫瘤遷徙能力。
　　在體外實驗中，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-rel

4、ated apoptosis-inducing ligand，TRAIL)對膠質瘤、神經(jīng)母細胞瘤、宮頸癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤都有誘導凋亡的作用。TRAIL對腫瘤細胞，如Hela宮頸癌細胞、A549肺癌細胞、人肝癌細胞、人乳腺癌細胞、早幼粒細胞有特異性的殺傷作用。體內的初步藥效學研究表明，TRAIL可顯著地抑制人肝癌細胞在小鼠體內的生長，但對正常小鼠無毒副作用。荷瘤動物應用重組的TRAIL蛋白后能夠明顯

5、抑制腫瘤細胞生長，甚至使腫瘤消退，而對宿主沒有明顯的損害。許多實驗表明，TRAIL與化療藥物相結合，有較好的抗腫瘤效果。因此TRAIL基因是理想的目標基因，具有明確的抑瘤作用，并且具備更深一步研究的前景。
　　目的：將ADSCs靶向腫瘤遷徙和TRAIL選擇性殺傷腫瘤細胞相結合，探索TRAIL修飾ADSCs雙重靶向治療腦膠質瘤的可能。
　　方法：1．人腹部皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪間充質干細胞ADSC，驗證干細胞的分化潛能。<

6、br>　　2.驗證脂肪間充質干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向腫瘤細胞遷移的特性。將腺病毒－綠色熒光蛋白（AAV-GFP）標記的ADSCs懸液加入與U87MG膠質瘤細胞共培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察綠色GFP陽性ADSCs的積聚狀態(tài)。體內在建立U87MG膠質瘤模型一周后，將LacZ標記的ADSCs靜脈途徑移植，觀察ADSCs的積聚情況。
　　3.從pROF-sTraIl質粒中獲得sTRAIL基因

7、片段，并將其重組于rAAV-GFP載體質粒中，生產(chǎn)出高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒顆粒。將其轉染ADSCs后，檢測其表達情況。
　　4.采用靜脈或瘤床內途徑注射sTRAIL修飾的ADSCs，治療裸鼠的U87MG腦膠質瘤模型，觀察對生存期的影響。
　　結果：1.人腹部皮下脂肪組織中分離出ADSCs，并在體外擴增成功，在條件培養(yǎng)基環(huán)境里能分化成成熟的脂肪細胞，成骨細胞和成軟骨細胞。
　　2.體外實驗中熒光顯微鏡下可

8、觀察到，GFP陽性ADSCs均聚積于U87MG膠質瘤細胞克隆中，在無膠質瘤細胞的區(qū)域未見GFP陽性細胞。體內在U87MG膠質瘤裸鼠模型中腦腫瘤內的Lacz陽性的ADSCs(117.52±36.13/seetIon)顯著高于對側正常腦組織(34.82±7.14/seetIon)和其它器官(心臟:0/seetIon；肺臟:28.54±7.56/seetIon:肝臟:18.63±5.27/seetIon:脾臟:7.67±5.73/seetIo

9、n:腎臟:31.78±12.04/seetIon)(p<0.001)。種植于腫瘤對側半球的ADSCs大部分沿著白質纖維束向U87膠質瘤遷徙。
　　3.高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒顆粒轉染ADSCs后，對其表型和細胞活性無明顯影響，ADSCs可穩(wěn)定表達sTRAIL。
　　4.采用靜脈或瘤床內途徑注射sTRAIL修飾的ADSCs，發(fā)現(xiàn)兩種方法均能顯著延長腦膠瘤裸鼠的生存期，其中有36%的ADSCs-sTRAIL治療組苛