氧化應(yīng)激對(duì)IL-37表達(dá)的影響.pdf

1、[目的]
　　1.研究過氧化氫對(duì)IL-37表達(dá)的影響。
　　2.從細(xì)胞水平研究IL-37過表達(dá)對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　[方法]
　　1.過氧化氫對(duì)細(xì)胞增殖的影響。用不同濃度過氧化氫(25、50、100、200、500、1000和1500μmol/L)作用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EA.hy926)和人胚腎細(xì)胞(293T)不同時(shí)間（1、3、6、9、12和20 h）后，采用CCK8法檢測過氧化氫對(duì)細(xì)胞增殖的影

2、響。
　　2.過氧化氫對(duì)細(xì)胞活性的影響。用不同濃度過氧化氫作用EA.hy926細(xì)咆不同時(shí)間后，收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液上清，分別檢測上清中乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)和細(xì)胞內(nèi)丙二醛(Malonaldehyde，MDA)水平。
　　3.過氧化氫對(duì)細(xì)胞IL-37表達(dá)的影響。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測過氧化氫刺激對(duì)EA.hy926細(xì)胞和293T細(xì)胞IL-37 mRNA表達(dá)的影響;用Western blot

3、檢測過氧化氫刺激對(duì)EA.hy926細(xì)胞和293T細(xì)胞IL-37蛋白水平的影響。
　　4.過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞IL-37表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。分別用5種不同的信號(hào)通路分子抑制劑，即p38MAPK抑制劑（SB203580，10μmol/L）、MEK1/2抑制劑（U0126，5μmol/L）、JNK抑制劑(SP600125，10μmol/L)、JAK抑制劑(AG490，10μmol/L)和PI3K抑制劑(LY294002，5μmol/L)

4、預(yù)先作用EA.hy926細(xì)胞30 min后，加入100μmol/L過氧化氫，分別作用3h和20 h。收集細(xì)胞，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測IL-37 mRNA及其蛋白表達(dá)水平。
　　5.IL-37真核表達(dá)載體的構(gòu)建。采用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增IL-37和EGFP基因，經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，用一段柔性Linker(GGGGS)3將兩個(gè)目的基因片段相連，構(gòu)建出IL37-1in

5、ker-EGFP融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察IL-37-EGFP融合蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測IL-37 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　6.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞使其過表達(dá)IL-37基因后，用500μ mol/L過氧化氫作用293T細(xì)胞20 h，以CCK8法檢測細(xì)胞活力;另收集培養(yǎng)液上清，檢測其中LDH水平。
　　[結(jié)果]
　　1.過氧化氫對(duì)EA.h

6、y926細(xì)胞增殖的影響
　　不同濃度H2O2（25、50、100、200、500、1000和1500μmol/L）處理EA.hy926細(xì)胞1、3、6、9、12和20 h后，用CCK-8法檢測其細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，較低濃度H2O2（25、50和100μmol/L）對(duì)EA.hy926細(xì)胞的增殖影響較小，即使培養(yǎng)至20 h，細(xì)胞活力仍保持在90％以上，與空白對(duì)照組比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。但是隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞的相對(duì)細(xì)

7、胞活力逐漸受到明顯的影響，用200μmol/L H2O2作用細(xì)胞3h時(shí)，細(xì)胞相對(duì)活力下降至87.4％，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)升高至500μmol/L以上時(shí)，即使作用細(xì)胞1h，細(xì)胞活力也顯著下降，與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且隨著作用時(shí)間延長，細(xì)胞的相對(duì)活力進(jìn)一步降低。
　　2.過氧化氫對(duì)293T細(xì)胞增殖的影響
　　不同濃度H2O2（100、200、50

8、0和1000μmol/L）處理293T細(xì)胞20 h后，用CCK-8法檢測其細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，200μmol/L過氧化氫處理組細(xì)胞活力開始降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且隨著濃度升高，細(xì)胞活力逐漸降低。
　　3.過氧化氫對(duì)EA.hy926細(xì)胞活性的影響
　　不同濃度過氧化氫刺激EA.hy926細(xì)胞不同時(shí)間后，收集細(xì)胞及其上清檢測其LDH和MDA水平。結(jié)果顯示，用50和100μmol/L等低濃度的過氧化

9、氫處理細(xì)胞時(shí)，上清中LDH水平的變化無明顯差異（P＞0.05）。當(dāng)用200μmol/L的過氧化氫處理細(xì)胞時(shí)，只有作用持續(xù)至20 h時(shí)，上清中LDH水平的變化才有明顯差異(P＜0.05)。進(jìn)一步升高過氧化氫的作用濃度時(shí)，即使作用短時(shí)間，上清中LDH水平也呈顯著的上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)用50μmol/L濃度的過氧化氫處理細(xì)胞時(shí)，其MDA水平無明顯變化(P＞0.05)，但當(dāng)過氧化氫濃度上升至100μmol/L時(shí)，MDA水

10、平則明顯升高，與對(duì)照組相比較具有顯著差異（P＜0.05），并隨著過氧化氫濃度的進(jìn)一步升高，MDA的水平也隨之進(jìn)一步升高。
　　4.過氧化氫對(duì)EA.hy926細(xì)胞IL-37表達(dá)的影響
　　不同濃度H2O2作用EA.hy926細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IL-37表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)4個(gè)不同濃度的H2O2處理細(xì)胞1h時(shí)，只有25μmol/LH2O2處理組未見有IL-37 mRNA水平明顯升高，其他3個(gè)濃度處理組細(xì)胞IL

11、-37mRNA水平明顯升高，其中，H2O2作用濃度上升至200μmol/L時(shí)，細(xì)胞IL-37mRNA水平比對(duì)照組高4.6倍，與對(duì)照組相比較，具有非常顯著差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。當(dāng)H2O2處理細(xì)胞時(shí)間上升至3h時(shí)，IL-37mRNA的表達(dá)水平繼續(xù)升高，其中100和200μmol/L H2O2處理組細(xì)胞IL-37 mRNA的表達(dá)水平分別高于對(duì)照組約4.4和4.9倍，與對(duì)照組相比較，具有非常顯著差異（P＜0.01）。當(dāng)H2O2處理細(xì)

12、胞時(shí)間上升至6h時(shí)，IL-37 mRNA僅比作用3h時(shí)稍升高或略降低。Western blot結(jié)果顯示用100μmol/L過氧化氫作用EA.hy926細(xì)胞20 h，細(xì)胞內(nèi)IL-37蛋白呈明顯的上調(diào)表達(dá)。
　　5.過氧化氫對(duì)293T細(xì)胞IL-37表達(dá)的影響
　　不同濃度H2O2作用293T細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IL-37表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，用25和50μmol/L過氧化氫作用1、3、6h后，IL-37 mRNA水

13、平均未見明顯升高（P＞0.05）;當(dāng)過氧化氫濃度升高至100μmol/L并作用3h后，IL-37表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0.05);而200μmol/L組作用3h后IL-37升高更加明顯(P＜0.01);當(dāng)作用時(shí)間延長至6h，100和200μmol/L組IL-37水平較3h繼續(xù)升高，與對(duì)照組相比差異均非常顯著(P＜0.01)。Western blot結(jié)果顯示分別用25、50、100和200μmol/L過氧化氫作用293T細(xì)胞20 h，

14、100和200μmol/L處理組細(xì)胞內(nèi)IL-37蛋白呈明顯的上調(diào)表達(dá)。
　　6.5種不同信號(hào)通路分子抑制劑對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞IL-37表達(dá)的影響
　　EA.hy926細(xì)胞經(jīng)p38MAPK抑制劑(SB203580)、MEK1/2抑制劑(U0126)、JNK抑制劑(SP600125)、JAK抑制劑(AG490)和PI3K抑制劑(LY294002)預(yù)處理30 min后，加入100μmol/LH2O2作用3h，實(shí)時(shí)熒

15、光定量PCR檢測，結(jié)果表明，與未使用抑制劑的對(duì)照組相比較，使用SB203580、AG490和LY294002的各組細(xì)胞內(nèi)IL-37 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01)，而U0126和SP600125組細(xì)胞內(nèi)IL-37表達(dá)水平稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而Westernblot結(jié)果顯示:與未用抑制劑組相比，各抑制劑組IL-37水平均有降低，其中SB203580、AG490、SP600125和LY294002組降低明

16、顯。
　　7.IL-37融合EGFP的真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　酶切和測序鑒定結(jié)果顯示，IL37-linker-EGFP融合基因正確克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1。重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IL37-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡檢測顯示綠色熒光蛋白在細(xì)胞中表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot分別檢測到高水平IL-37 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　8.過氧化氫對(duì)過表達(dá)IL-37的293T

17、細(xì)胞增殖的影響
　　以500μmol/L過氧化氫作用過表達(dá)IL-37基因的293T細(xì)胞20 h后，CCK8檢測結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　9.過氧化氫對(duì)過表達(dá)IL-37的293T細(xì)胞活性的影響
　　用500μmol/L過氧化氫作用過表達(dá)IL-37基因的293T細(xì)胞20 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　[結(jié)論]
　　1.