白藜蘆醇立方液晶納米粒的制備及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：制備白藜蘆醇立方液晶納米粒（resveratrol liquid crystalline nanoparticles。RES-LCNPs），對(duì)制備工藝及處方進(jìn)行篩選優(yōu)化，對(duì)優(yōu)化的RES-LCNPs觀察了形態(tài)，測(cè)定了粒徑、Zeta電位及DL和EE，考察了穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)了RES-LCNPs體外釋藥特性及機(jī)理，并研究了優(yōu)化的RES-LCNPs對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株（HepG2）和肺癌細(xì)胞株（A549）的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　方法：1

2、.在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Bottom-up法制備RES-LCNPs，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)制備工藝如攪拌速度、分散時(shí)間、超聲功率及處方因素包括穩(wěn)定劑種類、穩(wěn)定劑用量、脂質(zhì)材料單油酸甘油酸酯（glyceryl monooleate，GMO）用量、投藥量、水相體積進(jìn)行篩選。選擇對(duì)RES-LCNPs影響較大的因素（GMO﹕RES、RES濃度、穩(wěn)定劑濃度），采用效應(yīng)面-中心復(fù)合設(shè)計(jì)（response surface methodology-centra

3、l composite design，RSM-CCD）法以載藥量、包封率及穩(wěn)定性常數(shù)的總評(píng)歸一值（D）為響應(yīng)值對(duì)處方進(jìn)一步優(yōu)化。
　　2.通過(guò)透射電子顯微鏡觀察優(yōu)化的RES-LCNPs形態(tài)；應(yīng)用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑及zeta電位；對(duì)其DL和EE進(jìn)行了測(cè)定；用差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）鑒定RES是否被立方液晶納米粒子包封；考察了RES-LCNPs在4℃及25℃條件下

4、的貯存穩(wěn)定性，并對(duì)其凍干粉在4℃條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察；以1.5％的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液為釋放介質(zhì)，采用平衡透析法評(píng)價(jià)RES-LCNPs體外釋藥特性，并對(duì)其體外藥物釋放機(jī)制進(jìn)行擬合。
　　3.采用MTT法檢測(cè)優(yōu)化的RES-LCNPs對(duì)HepG2、A549細(xì)胞增殖的影響，用光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡觀察其誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的變化，流式細(xì)胞儀（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞

5、周期變化及細(xì)胞凋亡情況，Western blotting法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選的制備工藝為：攪拌速度1000 rmp，分散時(shí)間2 h，超聲功率150 W；篩選的最佳穩(wěn)定劑為聚乙烯醇15000（polyving akohol。PVA）。采用RSM法優(yōu)化所得最優(yōu)處方為GMO︰RES濃度比21.7:1、RES濃度0.4 g/L、PVA濃度0.91 g/L。因變量的理

6、論預(yù)測(cè)D值為0.592，實(shí)測(cè)D值為0.584±0.007，偏差為1.35%。
　　2.優(yōu)化的RES-LCNPs形態(tài)圓整、大小均勻、無(wú)粘連，平均粒徑為50.77±5.14 nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.249±0.063，zeta電位為-22.6±1.9 mV，DL和EE分別為4.21%、92.77%。DSC分析表明RES被納米粒子包裹。RES-LCNPs在25℃條件下，第21 d出現(xiàn)少量

7、絮狀沉淀，4℃條件下，第50 d出現(xiàn)少量沉淀，說(shuō)明RES-LCNPs在4℃條件下穩(wěn)定性好，RES-LCNPs凍干粉放置90 d載藥量、包封率、平均粒徑的變化很小，說(shuō)明RES-LCNPs凍干粉具有好的穩(wěn)定性。RES-LCNPs釋放8 h，RES的累積釋放率為66.62%，釋放36 h，RES的累積釋放率為80.76%，體外釋放結(jié)果表明其體外釋藥緩慢，且釋放機(jī)制符合Weibull方程，回歸方程為lnln[1/(1-Q)]=0.609lnt-

8、1.4202（r=0.9816）。
　　3.濃度為10μM、20μM、40μM、80μM的RES-LCNPs作用于HepG2和A549細(xì)胞24 h，隨著藥物濃度增加，抑制率升高。40μM RES-LCNPs分別作用于HepG2和A549細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率上升。RES-LCNPs處理的HepG2和A549細(xì)胞，與RES溶液組相比，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量少、折光度低、分布松散，熒光顯微

9、鏡觀察可見(jiàn)亮藍(lán)色熒光，且染色質(zhì)固縮、胞核聚集。FCM檢測(cè)表明，40μM RES-LCNPs作用于HepG2和A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞阻滯趨向G2/M期，且早晚期凋亡明顯。WB結(jié)果顯示，RES-LCNPs能促進(jìn)Bax表達(dá)、抑制Bcl-2的表達(dá)，具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)論：優(yōu)化的RES-LCNPs制備工藝可行、處方合理，形態(tài)圓整、無(wú)粘連、分布均勻、粒徑小，其凍干粉穩(wěn)定性良好，并具有明顯的緩釋作用。RES-LCNPs作用于H