轉(zhuǎn)基因家蠶-細(xì)胞表達(dá)hGM-CSF和綠色熒光蠶絲的制備.pdf

1、人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,hGM-CSF）是一造血刺激因子，能夠刺激T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖、成熟和分化，提高機(jī)體免疫力，具有十分重要的臨床應(yīng)用價值，在國際生物技術(shù)制藥市場上也占有重要的位置。
　　 家蠶（Bombyx mori）屬于鱗翅目蠶蛾科，能大規(guī)模飼養(yǎng)，遺傳背景比較清楚，其絲腺具有強(qiáng)大合成和分泌絲蛋白的能力。為探討在

2、家蠶絲腺特異性表達(dá)hGM-CSF的可能性，以家蠶絲素輕鏈基因（fib-L）組序列為左（約1.2kb）、右（約0.5kb）同源臂，用絲素重鏈基因（fib-H）啟動子控制hGM-CSF基因，家蠶肌動蛋白A3啟動子控制GFP報(bào)告基因，構(gòu)建了輕鏈基因打靶載體pSK-FibL-L-A3GFP-PH-GMCSF-LPA-FibL-R；通過精子介導(dǎo)法將該載體導(dǎo)入初產(chǎn)卵，首先在GO代通過綠色熒光篩選熒光蠶，由PCR和DNA雜交結(jié)果證實(shí)所篩選出的熒光蠶為

3、轉(zhuǎn)基因家蠶；western blot檢測結(jié)果顯示，在G3代后部絲腺組織中可檢測到分子量為22kDa的hGM-CSF特異性條帶；ELISA分析結(jié)果顯示，hGM-CSF在轉(zhuǎn)基因后部絲腺組織的表達(dá)水平為2700pg/g凍干粉。表明通過基因打靶可以將外源基因?qū)胂Ｍ募倚Q基因組位點(diǎn)，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。缺失絲素輕鏈基因的第6外顯子第30核苷酸下游區(qū)域不影響家蠶的吐絲結(jié)繭。
　　 為了能通過遺傳分子來改造家蠶絲，本研究構(gòu)建輕鏈基因打靶載體pSK-

4、FibL-L-GFP-FibL-R，以絲素蛋白輕鏈基因組終止密碼TAA上游1.2kb和TAA下游0.5kb左右的片段為同源臂，將綠色熒光蛋白（GFP）基因的DNA序列克隆進(jìn)二同源臂之間，使GFP基因的讀碼框與絲素蛋白輕鏈基因的讀碼框一致，轉(zhuǎn)基因載體通過精子介導(dǎo)法將該載體導(dǎo)入初產(chǎn)卵，并結(jié)合分子生物學(xué)檢測，獲得了能吐綠色熒光絲的基因打靶蠶。有關(guān)結(jié)果為分子設(shè)計(jì)改變蠶絲的性狀奠定了基礎(chǔ)。
　　 另外，我們建立了非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)

5、外源基因的轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞系，我們將家蠶核型多角體病毒極早期基因（ie-1）啟動子控制的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（ hGM-CSF）基因的表達(dá)盒克隆進(jìn)pIZT/V5-His獲重組pIZT-IE-hGM-CSF,該載體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞后，通過博萊霉素（zeocin）篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系IE-hGM-CSF。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組經(jīng)PCR鑒定，成功檢測到ie-hGM-CSF,western blot分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的重組hG