高糖通過氧化應(yīng)激反應(yīng)激活TNF受體調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:目前,關(guān)于糖尿病血管病變的機(jī)制尚未完全闡明,存在有多種假說,其中內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)功能失調(diào)使糖尿病血管新生受損的機(jī)制研究已經(jīng)受到廣泛重視。內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞完整性、促進(jìn)血管新生有重要作用,而高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能均有影響,主要使其凋亡增多,數(shù)量減少。糖尿病患者伴隨存在的氧化應(yīng)激狀態(tài),促使細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS進(jìn)而通過調(diào)控凋亡基因,激活凋亡受體等途徑,顯著增加細(xì)胞的凋亡,最終影響血管新生。腫瘤壞死因子(TNF-α)是一

2、種主要由單核-吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子,主要參與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控,其受體(TNFR1)在細(xì)胞凋亡的主要途徑死亡受體途徑中發(fā)揮重要作用。在高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激條件下,ROS激活TNFR1進(jìn)而誘導(dǎo)EPC的凋亡可能是糖尿病血管新生障礙的重要因?yàn)橹?。因此本?shí)驗(yàn)的研究目的在于,觀察體外高糖是否通過氧化應(yīng)激反應(yīng)激活TNF受體進(jìn)而對(duì)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)凋亡產(chǎn)生影響,探討高糖對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞影響。
　　 方法:1.骨髓EPC的分離

3、、培養(yǎng)和鑒定,倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)的EPC的形態(tài)、生長(zhǎng)及增殖情況。用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1檢測(cè)來鑒定EPC并計(jì)數(shù)。2高糖對(duì)EPCs的氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物MDA,GSH,抗O2-的影響。3.高糖及抗氧化劑對(duì)EPCs凋亡的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè),Annexin-Ⅴ陽(yáng)性的細(xì)胞認(rèn)為是凋亡細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。4.PCR檢測(cè)高糖及抗氧化劑對(duì)EPCs TNF-αmRNA的表達(dá)情

4、況。
　　 結(jié)果:1.骨髓來源的EPC在體外培養(yǎng)時(shí)呈梭形,貼壁生長(zhǎng),二者均表達(dá)CD34,CD133和VEGFR-2表達(dá),且能結(jié)合UEA-1并攝取ac-LDL,證明所培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。2.高糖作用24h后,與正常組相比,高糖干預(yù)組(30mmol／L,60mmol／L)EPCs的MDA,GSH濃度均無(wú)明顯差異,作用48h96h后,MDA,GSH濃度顯著增加(P<0.05),均高于對(duì)照組,并呈濃度及時(shí)間依賴性,15mmol／L高糖

5、組則無(wú)明顯增加。高糖作用48h,96h后,抗O2-濃度明顯減少(P<0.05),呈濃度及時(shí)間依賴性。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡表明高糖組凋亡率高于對(duì)照組以及TEMPOL干預(yù)組(8.29±0.33)％,(13.08±0.68)％vs(2.54±0.47)％,(2.76±0.44)％vs(4.41±0.72)％,(5.12±0.53)％,P<0.05。3.PCR檢測(cè)TNFR1 mRNA含量顯示在48h,96h時(shí)高糖組表達(dá)增多,(1.41

6、3±0.115,1.656±0.133 vs0.982±0.099,0.975±0.113,P<0.05)TEMPOL能夠抑制TNFR-1 mRNA的表達(dá)。(1.072±0.126,1.035±0.114 vs1.413±0.115,1.656±0.133P<0.01)。
　　 結(jié)論:1.高糖能夠引起EPC氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),抗氧化能力減弱,并呈時(shí)間和濃度依賴性。2.高糖能夠增加EPC早期凋亡率,抗氧化劑TEMPOL能夠抑制高糖引