抗氧化蛋白PrxII對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、內(nèi)毒素休克是臨床常見的全身性危重病癥，死亡率極高。內(nèi)毒素休克患者常伴有心肌炎性損傷和心功能不全，是患者死亡率增加的主要原因。因此防治內(nèi)毒素性心肌功能障礙對(duì)改善內(nèi)毒素血癥患者的預(yù)后具有重要意義。本課題以腺病毒Ad.PrxII為目的基因載體，脂多糖（LPS）為炎癥誘導(dǎo)因子，酶消化法分離得到的成年大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，從NF-κB信號(hào)通路入手，探討LPS刺激后的心肌細(xì)胞炎癥損傷的特征，觀察PrxII過(guò)表達(dá)是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作

2、用，并闡明其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分：腺病毒的擴(kuò)增、純化及其病毒滴度的測(cè)定
　　本部分采用HEK293細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用腺病毒純化試劑盒進(jìn)行純化，最后使用綠色熒光蛋白標(biāo)記法對(duì)其進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，計(jì)算其病毒滴度。
　　第二部分：成年大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　利用酶消化法分離培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞，并對(duì)分離得到的心肌細(xì)胞采用可視化動(dòng)緣探測(cè)

3、系統(tǒng)進(jìn)行收縮功能檢測(cè)，以確定其是否能夠用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　第三部分：PrxII過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　首先采用不同濃度的LPS（0，1，5，10μg/ml）處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞24 h，提取蛋白用于Western Blot檢測(cè)PrxII蛋白的表達(dá)變化；然后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞，同時(shí)以Ad.GFP作為對(duì)照，培養(yǎng)24 h后，提取蛋白用于免疫印跡檢測(cè)PrxII是否過(guò)表

4、達(dá)；最后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞，使其在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，同時(shí)加入Ad.GFP作為對(duì)照。采用LPS（10μg/ml）構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型，同時(shí)采用未加入LPS刺激但轉(zhuǎn)染了腺病毒（Ad.GFP和Ad.PrxII）的心肌細(xì)胞作為對(duì)照，培養(yǎng)24 h，采用MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞的活力，提取蛋白用于免疫印跡檢測(cè)蛋白 PrxII、Bcl-2、IκBα、p-IκBα和NF-κB的表達(dá)變化，以及NF-κB信號(hào)通路的激活。

5、同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII的滴度分別為1.8×1011/ml和1.08×1010/ml,均達(dá)到1×1010/ml以上，可以用于后續(xù)試驗(yàn)中。
　　2.可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)顯示，所分離的心肌細(xì)胞的肌節(jié)縮短分?jǐn)?shù)（FS％）為11.30%±0.94%，最大收縮速率（+dL/dt）為122.36±11.19μm/s，最大舒張速率（-dL/dt）為133.00±12

6、.16μm/s。
　　3.（1）構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型所用的LPS的最佳濃度為10μg/ml，LPS刺激后， PrxII蛋白的表達(dá)量下調(diào)，并且呈濃度依賴性，表明在應(yīng)激條件下，PrxII表達(dá)下調(diào)參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷；（2）MTT法顯示，PrxII可以改善心肌細(xì)胞的活力，對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌功能損傷具有保護(hù)作用；（3）Western Blot顯示，PrxII在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，PrxII對(duì)IκBα的磷酸化具有抑制作用，同時(shí)對(duì)NF-κB