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文檔簡介
1、內(nèi)毒素休克是臨床常見的全身性危重病癥,死亡率極高。內(nèi)毒素休克患者常伴有心肌炎性損傷和心功能不全,是患者死亡率增加的主要原因。因此防治內(nèi)毒素性心肌功能障礙對改善內(nèi)毒素血癥患者的預(yù)后具有重要意義。本課題以腺病毒Ad.PrxII為目的基因載體,脂多糖(LPS)為炎癥誘導(dǎo)因子,酶消化法分離得到的成年大鼠心肌細(xì)胞為研究對象,從NF-κB信號通路入手,探討LPS刺激后的心肌細(xì)胞炎癥損傷的特征,觀察PrxII過表達(dá)是否對LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作
2、用,并闡明其作用機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)方法:
第一部分:腺病毒的擴(kuò)增、純化及其病毒滴度的測定
本部分采用HEK293細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII進(jìn)行擴(kuò)增,然后使用腺病毒純化試劑盒進(jìn)行純化,最后使用綠色熒光蛋白標(biāo)記法對其進(jìn)行病毒滴度的測定,計(jì)算其病毒滴度。
第二部分:成年大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
利用酶消化法分離培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞,并對分離得到的心肌細(xì)胞采用可視化動緣探測
3、系統(tǒng)進(jìn)行收縮功能檢測,以確定其是否能夠用于后續(xù)試驗(yàn)。
第三部分:PrxII過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
首先采用不同濃度的LPS(0,1,5,10μg/ml)處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞24 h,提取蛋白用于Western Blot檢測PrxII蛋白的表達(dá)變化;然后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞,同時以Ad.GFP作為對照,培養(yǎng)24 h后,提取蛋白用于免疫印跡檢測PrxII是否過表
4、達(dá);最后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞,使其在心肌細(xì)胞中過表達(dá),同時加入Ad.GFP作為對照。采用LPS(10μg/ml)構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型,同時采用未加入LPS刺激但轉(zhuǎn)染了腺病毒(Ad.GFP和Ad.PrxII)的心肌細(xì)胞作為對照,培養(yǎng)24 h,采用MTT法測定心肌細(xì)胞的活力,提取蛋白用于免疫印跡檢測蛋白 PrxII、Bcl-2、IκBα、p-IκBα和NF-κB的表達(dá)變化,以及NF-κB信號通路的激活。
5、同時檢測培養(yǎng)基中LDH水平的變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII的滴度分別為1.8×1011/ml和1.08×1010/ml,均達(dá)到1×1010/ml以上,可以用于后續(xù)試驗(yàn)中。
2.可視化動緣探測系統(tǒng)顯示,所分離的心肌細(xì)胞的肌節(jié)縮短分?jǐn)?shù)(FS%)為11.30%±0.94%,最大收縮速率(+dL/dt)為122.36±11.19μm/s,最大舒張速率(-dL/dt)為133.00±12
6、.16μm/s。
3.(1)構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型所用的LPS的最佳濃度為10μg/ml,LPS刺激后, PrxII蛋白的表達(dá)量下調(diào),并且呈濃度依賴性,表明在應(yīng)激條件下,PrxII表達(dá)下調(diào)參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷;(2)MTT法顯示,PrxII可以改善心肌細(xì)胞的活力,對LPS誘導(dǎo)的心肌功能損傷具有保護(hù)作用;(3)Western Blot顯示,PrxII在心肌細(xì)胞中過表達(dá),PrxII對IκBα的磷酸化具有抑制作用,同時對NF-κB
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