呼吸道合胞病毒致大鼠腎病多種損傷機制研究：微小病變型腎病發(fā)病機理新探索.pdf

1、①呼吸道合胞病毒(RSV)接種大鼠，建立腎病大鼠模型，進一步確定RSV在該病發(fā)生發(fā)展中重要作用。②研究彈性蛋白酶(ELA)-a1抗胰蛋白酶(a1-AT)失衡，ELA酶解和所帶強陽電荷在RSV致大鼠腎小球損傷，尿蛋白增加，從而促進腎病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。③研究RSV感染細胞機理及其對腎小球濾過屏障損傷作用。④研究N-脫乙?；福疦-硫酸基轉移酶-1(NDSTl)在RSV致大鼠腎病中作用。探討RSV致大鼠腎病多種損傷機制，為微小病變型腎病

2、(MCNS)發(fā)病機理的深入研究提供新思路。 方法 1．以不同滴度RSV(6×10<'2>，6x10<'4>，6x10<'6>PFU)接種大鼠，觀察接種后4，8，14，28d(RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,l4>，RSV<,28>)光鏡、電鏡下腎組織結構改變；分析24h尿蛋白、尿糖胺聚糖(GAG)定量及血白蛋白、膽固醇、尿素氮和肌酐變化；并通過原位雜交及空斑形成試驗檢測腎、肺組織RSV。 2．酶底物法和

3、重氮復鹽顯色法分別檢測6x10<'6>PFU RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,14>，RSV<,28>組及相應正常對照大鼠血漿ELA和a1-AT活性；間接免疫熒光法觀察ELA在腎臟的表達和分布。 3．分別用ELA I(0.1μg／ml)和ELAII(0.5μg／ml)、ELA+低分子肝素(LMWH)、魚精蛋白、魚精蛋白+ELA、<,o>乙酰肝素酶(Hpa)、Hpa +ELA等處理體外培養(yǎng) Hela細胞，以PBS處理為

4、對照，然后接種 6x10<'1>pFU RSV，或6x10<'1>pFU RSV與LMWH孵育后再接種Hela細胞，通過原位雜交和空斑形成試驗分析RSV感染力。 4．實時熒光定量PCR和Western Blot分別檢測6x10<'6>PFU RSV<,4>，RSV<,8>，RSV<,l4>，RSV<,28>組及相應正常對照大鼠腎組織NDST-1 mRNA及蛋白表達。 結果 1．接種RSV后尿蛋白及尿GAG增加

5、，二者呈正相關關系，腎小球上皮細胞足突腫脹融合，尤以6×10<,6>pFU RSV<,l4，28>組表現(xiàn)最為典型，伴低白蛋白血癥，腎組織光鏡和電鏡下改變(足突廣泛融合)與人類MCNS 基本一致，且原位雜交顯示腎小球上皮細胞／系膜細胞及腎小管上皮細胞中均可見RSVRNA陽性信號表達。 2.6×10<'6> PFU RSV各組血漿ELA／al-AT均較正常對照組增高，且與尿蛋白及尿GAG含量呈顯著正相關關系。RSV<,4,8,14

6、>組腎組織均有ELA 表達，主要分布于腎小球基底膜(GBM)，以．RSV<,l4，8>組較強，與血漿ELA／al-AT變化趨勢一致，腎小管無明顯ELA表達。 3．體外實驗Hela細胞經(jīng)ELA(0.1μg／ml)、魚精蛋白、魚精蛋白+ ELA、npa、Hpa+ELA處理后，RSV感染力較PBS處理對照組降低，經(jīng)ELA+LMWH：處理后RSV感染力無明顯減低，而RSV先與LMWH孵育后再接種Hela細胞，則對細胞感染力明顯降低。H

7、ela細胞經(jīng)ELA(0.5μg／ml)處理后明顯脫落。 4.6×10<'6> PFU RSV各組NDST-1 mRNA及蛋白表達均較相應時間點正常對照組降低。RSV各組NDST-1 mRNA及蛋白表達均與尿蛋白定量呈負相關關系，而與尿GAG含量無明顯相關關系。 結論 1．RSV可致大鼠腎病綜合征。 2．RSV致大鼠腎病發(fā)生發(fā)展過程中，存在ELA—a1-AT失衡，ELA／al-AT增高，可能通過ELA分

8、解GBM上GAG或直接電荷中和致GBM陰離子電荷篩破壞，促進蛋白尿發(fā)生發(fā)展。這一機制在RSV腎病大鼠蛋白尿，尤其是前期蛋白尿形成中可能起重要作用。 3．體外細胞實驗提示RSV感染細胞需通過細胞表面硫酸乙酰肝素(HS)，主要通過RSV所帶陽電荷與細胞表面帶陰電荷的HS結合而作用；ELA對HS有降解作用，小劑量EIA可能通過其強陽電荷與細胞表面帶陰電荷HS結合，并通過分解細胞表面HS，致細胞表面陰電荷減少，RSV不能有效結合到細胞表