半相合基因效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞治療宮頸癌的小鼠模型研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)以小鼠宮頸癌U14細(xì)胞接種C57BL/6雌鼠，建立小鼠宮頸癌移植瘤模型。體外培養(yǎng)C57BL/6雌鼠及半相合基因鼠CB6F1(BABL/C×C57BL/6的雜交子一代，雌性)來(lái)源的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，作用于荷瘤C57BL/6雌鼠，檢測(cè)其對(duì)小鼠瘤組織中的STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表達(dá)的影響，觀察各組小鼠生存期、GVHR的嚴(yán)重程度。
　　 探討同源基因或半相合基因效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的抗瘤效

2、果，為臨床宮頸癌的治療提供新思路。
　　 方法:
　　 1、體外培養(yǎng)小鼠宮頸癌U14細(xì)胞，建立C57BL/6小鼠宮頸癌移植瘤模型。
　　 2、腫瘤抗原致敏的成熟DC制備:將C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓細(xì)胞，體外加入rmGM-CSF、rmIL-4、腫瘤抗原裂解液，LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)即可得到腫瘤抗原致敏的成熟DC。流式細(xì)胞儀分析其CD11c+、MHCⅡ+、CD86+細(xì)胞表面分子表達(dá)情況。
　　 3、效應(yīng)性T

3、細(xì)胞的制備:將C57BL/6、CB6F1小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)淋巴分離液分離獲得淋巴細(xì)胞，尼龍毛柱吸附法收集T淋巴細(xì)胞。培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞2天后，加入腫瘤抗原致敏的成熟DC，培養(yǎng)5天，即可得到效應(yīng)性T細(xì)胞。
　　 4、LDH法效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn):將C57BL/6、CB6F1效應(yīng)性T細(xì)胞與宮頸癌U14細(xì)胞以50∶1、25∶1比例混合，混合酬、時(shí)后，酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)液上清中LDH含量，計(jì)算效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。
　　 5、

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療:將荷瘤小鼠C57BL/6完全隨機(jī)分至3組，每組8只。PBS組（A組）:0.5mlPBS鼠尾靜脈注射，每5天1次，共注射3次;同源基因效應(yīng)性T細(xì)胞組（B組）:1×106個(gè)/0.5mlC57BL/6來(lái)源效應(yīng)性T細(xì)胞鼠尾靜脈注射，每5天1次，共注射3次;半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞組（C組）:1×106個(gè)/0.5mlCB6F1來(lái)源效應(yīng)性T細(xì)胞鼠尾靜脈注射，每5天1次，共注射3次。觀察各組小鼠生存期。
　　 6、免疫組化S

5、P法檢測(cè)荷瘤小鼠C57BL/6腫瘤組織STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表達(dá)情況，采用圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，用陽(yáng)性細(xì)胞百分比表示其含量。
　　 7、HE染色觀察各組小鼠瘤組織壞死情況、肝及小腸的病理改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、背部皮下接種1×106U14細(xì)胞的C57BL/6小鼠，約7天后肉眼可見(jiàn)接種部位腫塊直徑達(dá)0.5cm。
　　 2、腫瘤抗原致敏的成熟DC:細(xì)胞培養(yǎng)7

6、天后，大部分懸浮生長(zhǎng)，成簇明顯，細(xì)胞表面可見(jiàn)毛刺狀突起。流式細(xì)胞儀分析其CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞純度為92.4％，CD11c+CD86+細(xì)胞純度為88.8％。
　　 3、LDH法效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn):效靶比為50∶1條件下C57BL/6、CB6F1效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)U14細(xì)胞殺傷率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);效靶比25∶1條件下C57BL/6、CB6F1效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)U14細(xì)胞殺傷率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

7、r>　　 4、各組老鼠生存期:A組B組、A組C組小鼠生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B組C組小鼠生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 5、C57BL/6小鼠瘤組織免疫組化結(jié)果:A組和C組小鼠相比，瘤組織中STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。A組和B組小鼠相比，瘤組織中P-STAT3、TGF-β1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);瘤組織中STAT3、

8、IFN-γ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B組和C組小鼠相比，瘤組織中P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;瘤組織中STAT3表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6、HE染色結(jié)果:HE染色觀察各種小鼠瘤組織，B組和C組小鼠瘤組織較A組小鼠瘤組織壞死面積大。各組小鼠肝及小腸未見(jiàn)明顯病理變化。
　　 結(jié)論:
　　 1、在體外實(shí)驗(yàn)中，CB6F1來(lái)源的效應(yīng)性T

9、細(xì)胞與C57BL/6來(lái)源的效應(yīng)性T細(xì)胞都能夠殺傷小鼠宮頸癌U14細(xì)胞，且兩者殺傷率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2、C57BL/6來(lái)源的效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療，拮抗TGF-β1表達(dá)，P-STAT3低表達(dá)。
　　 3、CB6F1來(lái)源的效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療，除拮抗TGF-β1表達(dá)、P-STAT3低表達(dá)外，STAT3低表達(dá)、IFN-γ高表達(dá)。
　　 4、C57BL/6、CB6F1來(lái)源的效應(yīng)性T細(xì)胞作用于荷瘤C57BL/