漢族人群RhD抗原弱表現(xiàn)型的分子背景研究.pdf

1、目的：Rh血型系統(tǒng)是人類最復(fù)雜的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，也是輸血醫(yī)學(xué)最重要的血型系統(tǒng)之一，Rh血型抗原特別是RhD抗原(ISBT004.001；RH1)具有很強(qiáng)的免疫原性，是臨床上引致新生兒溶血病、溶血性輸血反應(yīng)的最重要的血型抗原。RHD基因由10個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)總長為1251bp，編碼417個(gè)氨基酸組成的糖蛋白。Rh血型有著復(fù)雜而豐富的遺傳多態(tài)性，不僅RhD陰性的分子遺傳機(jī)制呈現(xiàn)多態(tài)性，而且RhD抗原也存在多種變異體，包括弱D型、部分D型

2、和其它D弱表現(xiàn)形式的RhD抗原弱表現(xiàn)型。RhD抗原弱表現(xiàn)型可以引起同種免疫，在臨床輸血醫(yī)學(xué)實(shí)踐中有著非常重要的意義。本研究旨在探討中國漢族人群非血緣關(guān)系RhD抗原弱陽性個(gè)體的血型血清學(xué)表型及其分子遺傳背景，了解RhD抗原弱陽性個(gè)體在中國人群的分布及不同型別的分布頻率，以進(jìn)一步建立中國人RhD抗原弱表現(xiàn)型的最適定型方式及相關(guān)輸血策略，保證臨床輸血的安全。 方法：采用常規(guī)血型血清學(xué)技術(shù)，對非血緣關(guān)系的近214000名隨機(jī)漢族獻(xiàn)血者中

3、用單克隆IgG+IgM混合抗-D試劑進(jìn)行鹽水法初篩，鹽水介質(zhì)反應(yīng)陰性，經(jīng)抗球蛋白試驗(yàn)確認(rèn)仍為陰性者，判為RhD陰性個(gè)體；鹽水介質(zhì)反應(yīng)陰性，經(jīng)抗球蛋白試驗(yàn)確認(rèn)為陽性者，判為RhD抗原弱表現(xiàn)型；然后用單克隆IgM抗血清對RhD抗原弱表現(xiàn)型標(biāo)本進(jìn)行RhD、C、c、E、e抗原表型的檢測；采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)方法，用對中國人群最常見等位基因的6對序列特異性引物擴(kuò)增RHD基因，分別檢測RhD抗原弱陽性個(gè)體的RHD基因的

4、第1、5、6、9外顯子，RHD270A基因及DEL基因；采用SSP-PCR方法，用4對序列特異性引物擴(kuò)增RHCE基因，分別檢測RHCE基因的第2內(nèi)含子(檢測RHC)、第2外顯子(檢測RHc)、第5外顯子(檢測RHE)、第5外顯子(檢測Rhe基因)；對RhD抗原弱陽性標(biāo)本用10對內(nèi)含子引物分別特異性擴(kuò)增RHD基因10個(gè)外顯子，PCR產(chǎn)物純化后，分別以各外顯子的特異性測序引物直接測序，結(jié)果用相應(yīng)軟件分析比較；同時(shí)用PCR技術(shù)測定其RHD合子

5、型或RHD基因數(shù)目。 結(jié)果：在近214000名隨機(jī)漢族獻(xiàn)血者中，用血型血清學(xué)抗球蛋白試驗(yàn)共篩檢出RhD陰性個(gè)體747例，約占無關(guān)供者人群的0.35％；證實(shí)為D抗原弱陽性表型的32例，占無關(guān)供者人群的0.015％，其中弱D15型18例，RHD基因全長編碼區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)其第6外顯子存在一處堿基突變：845G＞A，其它部分與正常RHD序列相同，占D抗原弱陽性表型的56.3％，約占人群的0.00843％；弱D12型1例，為中國人群中首次

6、發(fā)現(xiàn)，RHD基因全長編碼區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)本的RHD第6處顯子存在一處堿基突變：830G＞A，編碼區(qū)序列其它部分與正常RHD序列相同，占D抗原弱陽性表型的3.1％，約占人群的0.00046％；1例為攜帶DEL等位基因的弱D型，RHD基因全長編碼區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)本的RHD第9外顯子存在一處堿基突變：1227G＞A，編碼區(qū)序列其它部分與正常RHD序列相同，占D抗原弱陽性表型的3.1％，約占人群的0.00046％；8例為部分D表型中的DⅥⅢ

7、型，測序結(jié)果顯示缺失RHD基因的第3-6外顯子，RHD基因序列分析第1、2外顯子和第7-10外顯子，結(jié)果顯示與正常RHD序列相同，占D抗原弱陽性表型的25％，約占人群的0.00375％；1例為部分D表型中的DVa(Hus)，RHD基因全長編碼區(qū)序列分析結(jié)果顯示第1-4外顯子和第6-10外顯子與正常RHD序列相同，第5外顯子與正常序列相比有8個(gè)相異點(diǎn)，即667T＞G，676G＞C，697G＞C，712G＞A，733G＞C，744C＞T,7

8、87G＞A，800A＞T，序列與RHCE基因相同，證實(shí)RHD基因的第5外顯子被RHCE基因替換。DVa占D抗原弱陽性表型的3.1％，約占人群的0.00046％；3例標(biāo)本10個(gè)外顯子檢測均未見異常，占D抗原弱陽性表型的9.4％，約占人群的0.0014％。Rh小因子檢測有3種表型CcEe(4例)、Ccee(10例)、ccEe(18例)，血清學(xué)與分子生物學(xué)檢測一致。RHD雜合性試驗(yàn)鑒定顯示僅表型為CcEe的4例標(biāo)本為純合型RHD+/RHD+，

9、提示基因型可能為DCe/DcE。其中2例標(biāo)本為弱D15型，另2例標(biāo)本中1例為DVa(Hus)部分D型別，1例為攜帶DEL等位基因的弱D型；其余28例標(biāo)本為雜合型RHD+/RHD-，推測基因型分別是DCe/dce(10例)和DcE/dce(18例)，其中14例弱D15基因可能存在于DcE單倍體中，2例弱D15基因可能存在于DCe單倍體中，弱D15基因存在于DCe單倍體上的個(gè)例在國內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見報(bào)道。以前在白種人所觀察到的弱D12型的弱D

10、基因存在于CDe單倍體中，推測本研究在中國人中發(fā)現(xiàn)的弱D12型個(gè)例弱D基因存在于DcE單倍體中，不同于白種人；8例DⅥⅢ型的RHD-CE(3-6)-D融合等位基因存在于DCe單倍體中；還有3例標(biāo)本未檢測出10個(gè)外顯子序列有異常，推測基因型是DcE/dce。 結(jié)論：研究表明中國漢族人群D弱表現(xiàn)型占無償獻(xiàn)血人群的0.015％，明顯低于白種人(0.2％-1％)，且分子遺傳背景呈現(xiàn)多樣性，有多種D弱表現(xiàn)型存在；漢族人群D弱表現(xiàn)型中，弱D

11、15型頻率最高，占56.3％，在白種人中，70.3％為弱D1型；漢族人群部分D(partialD)的弱表現(xiàn)型中，DⅥⅢ型占主要比率。 研究首次在中國人群中觀察到弱D12型，弱D基因所存在的單倍體不同于白種人。根據(jù)對RHD基因數(shù)目分析，推測中國人群中弱D15基因存在于DCe和DcE單倍體上，其中弱D15基因存在于DCe單倍體上的個(gè)例在國內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見報(bào)道。 這是國內(nèi)首次對中國漢族人群RhD抗原弱陽性分子背景的系統(tǒng)研究報(bào)道