漢族人群中醛固酮瘤患者基因突變的研究.pdf

1、目的:最近研究表明醛固酮瘤中發(fā)生的散發(fā)性和遺傳性突變?cè)谠摷膊“l(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,目前發(fā)現(xiàn)的突變基因包括KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3和CACNA1D。但目前在國(guó)內(nèi)關(guān)于這些基因的突變尚無(wú)大樣本量的研究。本實(shí)驗(yàn)主要研究上述基因在漢族人群醛固酮瘤中的突變和表達(dá)情況,并分析突變與病人臨床表型之間的關(guān)系,為臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。
　　方法:1.提取114例APA組織DNA,其中87例APA組織的RNA和外周血DNA,

2、將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,將DNA以及cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序,以檢測(cè)組織中各基因的突變情況,并分析各基因突變情況與臨床表型的關(guān)系;2.采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)APA組織中KCNJ5基因的mRNA和蛋白的表達(dá);3.對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的兩種KCNJ5突變?cè)贖EK293和H295R細(xì)胞系中進(jìn)行功能驗(yàn)證,通過(guò)MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖;使用DiSBAC2熒光染料檢測(cè)細(xì)胞膜電位,醛固酮放射免疫分析試劑盒檢測(cè)醛固酮濃度,RT-PC

3、R檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:1.114例APA病人中86例病人存在有KCNJ5基因的突變(75.44％),這些突變包括已經(jīng)報(bào)道的G151R,L168R和T158A,還有兩個(gè)尚未報(bào)道的新突變,一個(gè)同時(shí)存在E147Q點(diǎn)突變和9個(gè)堿基的插入突變,另一個(gè)病人為36個(gè)堿基的重復(fù)突變,即G153_G164dup。ATP1A1和ATP2B3基因并沒(méi)有檢測(cè)到突變,僅有一個(gè)病人檢測(cè)到有CACNA1D基因的突變(V748I),該突變也尚未報(bào)道。2

4、.與國(guó)外其他研究相比,本研究中男性APA病人與女性病人有較相似的KCNJ5基因突變率(75.47%對(duì)74.19%)。相對(duì)未突變的患者,KCNJ5基因突變的APA患者有較高的術(shù)前收縮壓和血醛固酮濃度,較低的術(shù)前血鉀,對(duì)體位試驗(yàn)反應(yīng)更不敏感。3.RT-PCR結(jié)果顯示KCNJ5基因和CYP11B2基因的mRNA表達(dá)在突變的APA組織中更高。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示發(fā)生KCNJ5基因突變的醛固酮瘤組織KCNJ5蛋白的染色異質(zhì)性更大;未發(fā)生該基因突變

5、的醛固酮瘤組織也有染色,但各部分組織染色一致性較好;無(wú)功能腺瘤中KCNJ5蛋白的染色呈陰性。4.將表達(dá)兩種KCNJ5新突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中后可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減低,在熒光顯微鏡下觀察,使用染料DiSBAC2后顯示轉(zhuǎn)染兩種突變型質(zhì)粒后的細(xì)胞更多熒光染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),說(shuō)明細(xì)胞膜電位發(fā)生了去極化;將表達(dá)兩種KCNJ5新發(fā)突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入H295R細(xì)胞后,KCNJ5-M1(同時(shí)存在點(diǎn)突變及插入突變)和KCNJ5-M2(重復(fù)突變)分別使醛固酮

6、分泌增加了2.27倍和2.10倍,加入血管緊張素II刺激24小時(shí)后兩種質(zhì)粒分別使醛固酮分泌增加了1.40倍和1.34倍。
　　結(jié)論:1.KCNJ5基因在漢族人群醛固酮瘤患者中突變率較國(guó)外高,未發(fā)現(xiàn)有ATP1A1和ATP2B3基因突變;2.男性APA病人KCNJ5基因突變率與女性病人相似;3.KCNJ5基因和CYP11B2基因在KCNJ5突變的APA病人腫瘤組織中mRNA表達(dá)更高,而KCNJ5蛋白在突變腫瘤組織中表達(dá)不均一,無(wú)突變腫