HSP47-shRNA干預日本血吸蟲鼠肝纖維化對活化的HSC受體表達的影響.pdf

1、【背景及目的】
　　全球約有2億人感染血吸蟲,流行于亞、非、拉,中國屬重感染區(qū)之一,其中1億2千萬人有臨床癥狀,2千萬人發(fā)病[1,2]。目前在中國仍有多達5千萬人面臨日本血吸蟲感染的危險[3]。作為危害人類健康的常見寄生蟲疾病,血吸蟲肝纖維化的發(fā)病機制和治療方面的研究仍是臨床基礎研究的重點之一。
　　血吸蟲病肝纖維化在引起機體致病的同時,機體也會對血吸蟲形成耐受機制,也因蟲體抗原偽裝逃避機體攻擊而得以長期寄生。蟲卵沉積和肉芽

2、腫反應導致纖維組織在肝臟中的積累,尤其門脈周圍纖維化阻塞通往肝臟的血流,最終形成門靜脈高壓。門靜脈高壓癥(portalhypertension,PHT)是一種常見的臨床綜合征,可引起嚴重并發(fā)癥危及生命。內(nèi)皮素(endothelin,ET),作為迄今發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管肽類物質(zhì),它于1988由日本學者Yanagisawa等[4]從豬主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中分離出來,分別有三種異構肽:ET-1、ET-2、ET-3;其中,ET-1對血管平滑肌的作

3、用最強。內(nèi)皮素受體(endothelinreceptor,ETR)則分為ETAR和ETBR,ETAR與ET的親和力表現(xiàn)為:ET-1>ET-2?ET-3,ETBR則與三種異構肽親和力相同。眾所周知,ETR的表達數(shù)量及功能決定了ET的生物學效應。動物體內(nèi)許多組織都能同時表達ETAR和ETBR,但各組織的ETR比例卻各有不同;組織ETR的分布情況決定了ET在該組織的作用,ET與其受體之間也可能存在負反饋調(diào)節(jié)機制;在PHT的不同階段,同一組織內(nèi)

4、皮素受體的表達分布也不相同;有關ETR受體拮抗劑已經(jīng)為藥物治療提供了新的研究領域。
　　肝纖維化發(fā)生發(fā)展離不開肝星狀細胞(Hepaticstellatecells,HSCs)持續(xù)激活。HSCs在激活的過程中會表達細胞因子及其受體,如ET-1和ET-1A、B型受體、轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)和TGF-βI、II、III型受體、血小板衍生的生長因子Plateletderivedgr

5、owth-factor,PDGF)和PDGF受體的α、β亞單位等等。低氧、年齡、活化狀態(tài)、分布密度等均可影響HSCs表面受體的表達。HSCs與內(nèi)皮素系統(tǒng)(Endothelinsystem,ETS)相互作用,其效應在肝內(nèi)外血管阻力形成、門靜脈血流量變化及肝纖維化進展中都起到關鍵作用[5,6]。
　　HSP47(heatshockprotein47,HSP47)是機體受到應激后合成增加的應激蛋白,主要存在于肝星狀細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,參與膠

6、原的折疊與分泌,影響肝纖維化的進展[7]。HSP47在多種疾病纖維化病理過程中顯著上調(diào),其參與膠原合成,其表達量影響纖維化進展;抑制HSP47表達可抑制膠原合成及組織纖維化[8,9]。血吸蟲感染所引起的肝纖維化與ETR表達的關系,國內(nèi)外報道甚少;HSP47在肝纖維化病理過程中究竟如何調(diào)控,目前也有待進一步深入研究;本研究旨在應用HSP47-shRNA干預鼠血吸蟲肝纖維化,探索其對HSCs受體表達的影響,尋找新的診斷指標及治療靶點。

7、>　　【方法】
　　利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術,將本實驗構建的HSP47-shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細胞(NIH/3T3細胞),同時設立非相關對照組(Negativecontrol-shRNA)。分別利用實時定量PCR和western-blot方法檢測NIH/3T3細胞HSP47mRNA及蛋白水平的表達;流式檢測轉(zhuǎn)染后NIH/3T3膜受體表達。上述同樣分組,將shRNA干擾質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈高壓注射,自日本血吸蟲小鼠感染第9W開始干預至

8、感染第14W,動態(tài)檢測模型門靜脈壓力改變;實時定量PCR和western-blot檢測體內(nèi)干預HSP47效應;流式檢測HSCs膜受體表達變化。
　　【結(jié)果】
　　Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染后NIH/3T3細胞HSP47-mRNA表達,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h(圖2,A)干擾質(zhì)粒對HSP47-mRNA抑制相對表達量為(25.39±2.358)％、轉(zhuǎn)染48h(圖2,B)為(48.71±1.391)%,分別于同轉(zhuǎn)染時間非相關對照組

9、比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。同時檢測轉(zhuǎn)染48hHSP47蛋白表達,結(jié)果與HSP47-mRNA一致。同時利用流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染后ET-B受體表達,轉(zhuǎn)染48h為(30.825±5.460)%,與轉(zhuǎn)染前(53.433±5.243)%有顯著差異(p<0.05)。TGF-β受體、PDGF受體分別檢測,轉(zhuǎn)染前后均無顯著變化。
　　感染第9周,尾靜脈注射HSP47-shRNA至感染第14W,HSP47-mRNA相對表達量下調(diào)至(2

10、.686±0.7114),與對照組(6.001±0.4583)比較,具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。HSP47蛋白表達經(jīng)Western-blot檢測,與mRNA變化一致。ShRNA干預組HSCsETAR與ETBR平均熒光強度(MFI)與感染組相比,均顯著變化(p<0.05)。ETAR由感染組(8538±493.71)降至(4249±344.42),ETBR則由感染組(5052±212.93)降至干預組(3706±193.76)。