PGRN和IL-12家族在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的表達及意義.pdf

1、第一部分、PGRN在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的表達及其與疾病活動性的關系
　　研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多發(fā)于孕齡期婦女的自身免疫性疾病，常累及機體多個組織器官，發(fā)病原因至今不明。SLE的病理特點是多種自身抗體的過量表達和大量免疫復合物的沉積。由于SLE累及多個系統(tǒng)和器官，因此患者的生活質量受到很大影響。在SLE患者機體中，促炎性細胞因子和抑炎性細胞因子的

2、分泌過量調控紊亂，最終導致了機體組織和器官的炎癥反應及損傷。顆粒蛋白前體(Progranul in，PGRN)也稱之為顆粒蛋白-上皮素前體(granulin-epithel in precursor，GEP)，前列腺癌細胞衍生生長因子(prostatic cancer-cell derived growth factor，PCDGF)，上皮素前體(proepithelin)等，由顆粒體蛋白(granul in，GRN)基因編碼，是一種具

3、有多種生物學功能的自分泌因子。PGRN大量表達于淋巴細胞，神經元，免疫細胞，增殖活躍的上皮細胞和軟骨細胞中。諸多研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在多種生理性和病理性過程中發(fā)揮著關鍵性的作用。例如胚胎的早期發(fā)育，創(chuàng)傷愈合和組織重構，炎癥反應，免疫反應等。PGRN也是一個重要的神經營養(yǎng)因子，有研究發(fā)現(xiàn)GRN基因變異引起的PGRN蛋白的部分丟失可導致額顳葉癡呆。此外PGRN也是一個參與了軟骨發(fā)育和降解的重要調節(jié)因子。Tang W等報道發(fā)現(xiàn)PGRN與腫瘤壞死

4、因子(tumor necrosis factor，TNF)受體結合，阻斷TNF-α的信號轉導，從而明顯拮抗膠原誘導關節(jié)炎小鼠模型的關節(jié)炎癥反應。因此，PGRN可能是未來治療自身免疫性疾病的新靶點。然而，PGRN在SLE患者中的表達至今未有報道。糖皮質激素(Glucocorticoid，GC)是治療SLE的常用藥物，通過基因組途徑和非基因組途徑抑制許多因子的表達和功能。但是糖皮質激素是否對PGRN的表達有影響尚未明確。
　　基于上述

5、觀點，我們在此項研究中檢測了SLE患者及健康對照人群外周血中PGRN，IL-6，蛋白酶3(proteinase3，PR3)，TNFR，TNF-α的表達濃度及mRNA的表達水平，及抗dsDNA抗體的血清濃度，以探討PGRN在SLE患者中的作用及其與疾病活動性的關系。此外，還觀察了糖皮質激素對PGRN表達水平的影響。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　篩選30例新診斷的SLE患者進入實驗組，他們全部符合1997年美國風

6、濕病學院修訂的SLE的分類標準。所有實驗組患者的SLEDAI(systemic lupuserythematosus disease activity index)評分≥10，入組前都未接受糖皮質激素及其它免疫抑制劑的治療，并在用藥前采集第一次外周血樣。入組后所有患者均接受了糖皮質激素治療，即潑尼松1 mg/kg/day。連續(xù)給予潑尼松3周后再次采集外周血樣。選取30例性別年齡匹配的來我院查體的健康人進入對照組。所有研究對象均簽署了山東

7、大學齊魯醫(yī)院臨床倫理委員會的知情同意書。
　　2.實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析各細胞因子mRNA的表達
　　在實驗組SLE患者接受潑尼松治療的前后分別收集5ml外周抗凝血，用紅細胞裂解液提取外周血中的單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PMBC)，根據說明書用Trizol法提取PMBCs的總RNA。核酸蛋白測定儀初步測定RNA的濃度并標準化至1 ug/ml以利于接下來的

8、反轉錄步驟。用反轉錄試劑盒獲取cDNA后進行實時定量PCR檢測PMBCs中PGRN的mRNA的表達水平。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測外周血清細胞因子的濃度
　　在實驗組SLE患者接受潑尼松治療前后分別收集5ml外周自凝血，凝固后離心分離出血清，儲存在-80℃條件下。按照說明書用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測血清中PGRN，IL-6，PR3，TNFR和

9、抗dsDNA抗體的血清濃度。
　　4.統(tǒng)計分析
　　用SPSS17.0軟件進行結果的統(tǒng)計分析。數據用中位數±四分位距表示。PGRN的分布為非正態(tài)分布，采用非參數檢驗。糖皮質激素治療前組和治療后組數據的分析采用兩個相關樣本的非參數檢驗。實驗組和對照組之間的數據分析采用兩個獨立樣本的非參數檢驗。PGRN與IL-6，PR3，TNFR，TNF-α及抗dsDNA抗體之間的關系用斯皮爾曼等級相關進行分析。認為P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意

10、義。
　　研究結果：
　　1.研究對象的臨床特點
　　實驗組的30例SLE患者中，男性7例，女性23例，年齡12-52歲，平均28.4±9.3歲。病程1-37月，平均12.6±10.1個月。實驗組患者的SLEDAI評分，治療前范圍10-23分，平均15.1±3.8分，治療后范圍是6-22分，平均12.2±4.0分。對照組包括女性23例，男性7例，年齡在18-59歲之間，平均30.1歲。
　　2.SLE患者外周血清

11、中PGRN水平升高
　　治療前SLE患者外周血清中PGRN（17.82±5.18，p＜0.01），IL-6(1.56±1.18,p＜0.01), TNFR(17.50±10.33, p＜0.01), TNF-α(89.59±20.27, p＜0.01), PR3(49.33±18.85,p＜0.01)和dsDNA抗體(208.19±194.24，p＜0.01)的濃度均高于正常對照組。在SLEDAI評分≥10的SLE患者中，PGRN

12、外周血清濃度顯著升高(p＜0.05)。治療后SLE患者與治療前SLE組相比，外周血清中PGRN濃度顯著下降(13.64±4.51，p=0.002)。治療后SLE患者外周血清中PGRN濃度顯著仍高于對照組人群(11.09±1.62，p=0.002)?？傊?，無論是治療前還是治療后SLE患者外周血清中PGRN的表達均高于正常對照人群。治療后SLE患者外周血清中IL-6(0.97±0.37,p=0.001),TNFR(10.61±3.70,p=

13、0.025)和TNF-α(54.31±17.17,p=0.012),PR3(48.25±10.89，p＜0.01)濃度均高于對照組人群。治療前IL-6，TNFR和TNF-α，濃度高于治療后SLE患者(p＜0.05)。PR3在治療前和治療后SLE患者中的表達差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　3.SLE患者PMBCs中PGRN mRNA高表達
　　我們用與內參基因GAPDH比較后的倍數表示PGRNmRNA表達水平的變化。與

14、對照組相比，治療前SLE患者PGRN mRNA表達相對數值升高了4.4倍(P＜0.01)（圖1）。治療后SLE患者與治療前相比，PGRN mRNA表達相對數量下降了1.34倍(P＜0.05)。
　　4.激素治療下調SLE患者的PGRN及其它炎癥因子的表達水平
　　在實驗組中，經過GC治療后，外周血清中PGRN(13.64±4.51，P=0.02)， IL-6(0.97±0.37,P=0.022), TNFR(10.61±3.

15、70,P=0.003), TNF-α(54.31±17.17,P=0.001)和anti-dsDNA抗體(137.02±80.71，P=0.038)的濃度明顯下降。但是PR3無明顯變化(48.25±10.89，P=0.549)。治療后SLE患者與治療前相比，PGRN mRNA表達相對數量下降了1.34倍(P＜0.05);同時IL-6(P＜0.05)TNF-α(P＜0.05) and TNFR(＜0.05) mRNA表達亦明顯下降。

16、>　　5.SLE患者PGRN與其它炎癥反應因子的關系
　　為了明確在SLE患者中PGRN表達水平與炎癥反應因子之間的關系，我們用斯皮爾曼等級相關分析了PGRN與IL-6，TNFR，TNF-α，PR3和抗dsDNA抗體之間的相關性。結果顯示，治療前的SLE患者外周血清PGRN水平與IL-6(r=0.790,P＜0.01), TNFR(r=0.559,P=0.01), TNF-α(r=0.438,P=0.015)和抗dsDNA抗體(r

17、=0.906，P＜0.01)具有顯著相關性。經過GC治療后，PGRN濃度仍與IL-6(r=0.836,P＜0.01), PR3(r=0.396,P=0.031), TNFR(r=0.533,p=0.02),TNF-α(r=0.378，P=0.039)和抗dsDNA抗體(r=0.712，P＜0.01)顯著相關。但是治療前組中，PGRN與PR3的濃度無顯著相關性(r=0.298，P=0.110)。
　　結論：
　　我們檢測了PG

18、RN在SLE患者外周血中的表達水平，初步探討了PGRN在SLE的表達及意義。本研究結果得到以下的結論:(1).PGRN在活動性及穩(wěn)定性SLE患者的外周血清中濃度顯著高于健康對照人群，PMBC的mRNA的表達亦高于健康對照人群;(2).PGRN的受體TNFR，PR3，IL-6，TNF-α及抗dsDNA抗體在活動性狼瘡患者中均高表達;(3).無論在治療前還是治療后SLE患者中PGRN的濃度與IL-6及抗dsDNA抗體濃度線性相關;(4).糖

19、皮質激素可顯著降低PGRN在SLE患者中的表達?？傊?，PGRN參與了SLE的發(fā)生發(fā)展過程，且濃度的高低與SLE的疾病活動性相關。我們認為PGRN作為TNF/TNFR的拮抗劑，可能是將來治療SLE的一個強有力的新靶點。
　　第二部分、糖皮質激素下調系統(tǒng)性紅斑狼瘡IL-12家族因子的表達
　　研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多態(tài)性的自身免疫性疾病今病因

20、不明。SLE多發(fā)生在20歲到40歲之間的婦女。SLE發(fā)病的病理特點是自身抗體的高表達和免疫復合物的沉積，常常累及機體的多個系統(tǒng)和器官。SLE的病因不明，其發(fā)病和遺傳，環(huán)境的相互作用有關。自身免疫耐受平衡的打破導致了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，SLE也不例外。 IL-12家族包括IL-12，IL-23，IL-27和IL-35，它們都是異二聚體，具有調節(jié)免疫系統(tǒng)的多種生物學功能。IL-12是由p35和p40兩個亞單位組成的異二聚體，對于Th1

21、細胞的分化至關重要。IL-23由p40和p19兩個亞單位組成。IL-12和IL-23是促炎癥反應因子，分別調節(jié)Th1和Th17細胞的發(fā)育。IL-27由EBI-3和p28兩個亞單位組成，起初被認為是促炎癥反應因子，最近發(fā)現(xiàn)它是一個免疫調節(jié)因子。IL-35是近年分離出的新的IL-12的家族成員，由EBI-3和p35組成，是強有力的抑炎因子，由胸腺來源的自然調節(jié)T細胞產生。糖皮質激素(Glucocorticoids，GCs)是強有力的抗炎和抑

22、制免疫藥物，廣泛應用于治療SLE，皮肌炎等自身免疫性疾病。糖皮質激素抑制白細胞向炎癥反應部位遷移并通過調節(jié)基因表達破壞白細胞，成纖維細胞和內皮細胞的功能;可以明顯減少促炎性細胞因子的表達，例如IL-2，IL-6，TNF-α和前列腺素(prostaglandins，PGs)。目前IL-12，IL-23，IL-27和IL-35在SLE患者疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用未知。在本研究中我們將探討這些因子在SLE患者中的表達及糖皮質激素治療對它們的影

23、響。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　篩選30例新診斷的且SLEDAI(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index)評分≥i0的SLE患者進入實驗組。他們的診斷均符合1997年美國風濕病學院修訂的SLE的分類標準。所有的實驗組患者入組前都未接受糖皮質激素及其它免疫抑制劑的治療。入組后所有患者均接受了激素治療，即潑尼松1 mg/kg/day。連續(xù)給予潑尼松2

24、周后再次采集外周血樣。對照組包括30例年齡性別相匹配的健康成年人。所有研究對象均簽署了山東大學齊魯醫(yī)院臨床倫理委員會的知情同意書。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測外周血清IL-12家族各因子的濃度
　　在激素治療前后分別收集5ml外周血，凝固后離心取得血清，儲存在-80℃條件下。按照說明書用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA)檢測血清中IL-12， IL-23， I

25、L-27， IL-35， IL-6和抗dsDNA抗體血清濃度。
　　3.統(tǒng)計分析
　　用SPSS17.0軟件進行結果的統(tǒng)計分析。數據用中位數±四分位距表示。糖皮質激素治療前組，治療后組和對照組之間的數據分析采用非參數檢驗。IL-12家族各因子與IL-6和抗dsDNA抗體之間的關系用斯皮爾曼等級相關進行分析。認為P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
　　1.研究對象的臨床特點
　　實驗組的30例S

26、LE患者中，男性7例，女性23例，年齡13-52歲，平均28.4±9.4歲。病程1-37月，平均12.9±10.1個月。實驗組患者的SLEDAI評分，治療前范圍10-23分，平均15.2±3.8分，治療后范圍是6-22分，平均12.4±4.0分。
　　2.SLE患者外周血清中IL-12家族各因子水平升高，糖皮質激素治療后下降
　　結果顯示，治療前SLE患者外周血清中IL-12，IL-23，IL-27，IL-35，IL-6和抗

27、dsDNA抗體的濃度均高于正常對照組(p＜0.05)。治療后，IL-12， IL-23，IL-27，IL-35，IL-6和抗dsDNA抗體的濃度明顯下降，且IL-23，IL-27，and IL-35的水平與正常對照組無顯著差異。
　　3.SLE患者IL-12，IL-23，IL-27，IL-35與IL-6和抗dsDNA抗體的關系
　　結果顯示，治療前的SLE患者外周血清IL-12水平與IL-6(r=0.897，P＜0.01)，

28、和抗dsDNA抗體((r=0.607，P＜0.01)具有顯著相關性。經過GC治療后，IL-12濃度仍與IL-6(r=0.897，P＜0.01)和抗dsDNA抗體((r=0.651，P＜0.01)顯著相關。此外IL-23，IL-27，IL-35的水平分別與IL-6和抗dsDNA抗體水平呈顯著相關性。
　　結論：
　　我們的研究顯示，IL-12家族各因子在SLE患者中高表達。IL-12與IL-23與疾病的活動性相關。因此我們需要