肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞浸潤減少及功能缺陷的機(jī)制研究.pdf

1、本課題從肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞浸潤減少及效應(yīng)功能受抑制的基本現(xiàn)象出發(fā)，研究γδT細(xì)胞效應(yīng)功能受抑制的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究闡明了肝癌局部免疫抑制分子與γδT細(xì)胞作用的內(nèi)在機(jī)制，豐富免疫逃逸理論，揭示腫瘤局部γδT細(xì)胞功能抑制的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)完善以γδT細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療策略以及探尋恰當(dāng)?shù)拿庖咧委煵呗杂泻艽蟮拇龠M(jìn)作用。
　　第一部分 肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞浸潤減少及功能缺陷的研究
　　本研究旨在探索γδT細(xì)胞在肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)不同部

2、位中（外周血、癌旁肝組織、肝癌病灶）的分布與和功能。
　　通過不連續(xù)密度梯度離心法分離同一肝癌患者外周血單核細(xì)胞、癌旁浸潤淋巴細(xì)胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs)及肝癌浸潤淋巴細(xì)胞(Tumorinfiltrating lymphocytes; TILs)，借助流式細(xì)胞技術(shù)分析不同部位γδT細(xì)胞分布及表型差異;借助RT-PCR技術(shù)分析不同部位γδT細(xì)胞表型差異;利用免疫組織化學(xué)染色

3、分析肝癌組織及癌旁組織中γδT細(xì)胞浸潤特點(diǎn)及絕對(duì)計(jì)數(shù)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌患者γδT細(xì)胞在配對(duì)的癌旁肝組織高于外周血（13.22±8.44％vs12.96±8.82％，mean±SD; P=0.046），在肝癌組織中的浸潤明顯低于配對(duì)的癌旁肝組織（13.22±8.44％vs6.33±5.61％，mean±SD;P=0.0002）。免疫組化染色顯示γδT細(xì)胞在實(shí)質(zhì)區(qū)及間質(zhì)區(qū)均有浸潤;通過比較癌與癌旁單位面積中TCRG+細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)肝癌內(nèi)T

4、CRG+細(xì)胞浸潤明顯減少，癌旁肝組織明顯高于癌內(nèi)（17.10±11.25 vs4.42±15.40，mean±SD;P＜0.001）。肝癌組織中γδT細(xì)胞表達(dá)IL-12Rb1、IL-12Rb2和IL-18Ra比例，與配對(duì)的癌旁肝組織無明顯差異，表達(dá)IL-18Rb的比例，癌內(nèi)相對(duì)配對(duì)的癌旁肝組織有明顯下降;CCL18和CD276mRNA癌內(nèi)表達(dá)明顯高于癌旁，而CD40 ligend和Fas ligend mRNA癌內(nèi)表達(dá)明顯低于癌旁。

5、r>　　本實(shí)驗(yàn)表明肝癌組織內(nèi)γδT細(xì)胞浸潤較癌旁組織明顯減少及功能缺陷。
　　第二部分 肝細(xì)胞癌內(nèi)高、低γδT細(xì)胞浸潤組趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)研究
　　本研究目的是探索肝細(xì)胞癌高、低γδT細(xì)胞浸潤組趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)差異。
　　通過不連續(xù)密度梯度離心法分離同一肝癌患者癌旁浸潤淋巴細(xì)胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs）及肝癌浸潤淋巴細(xì)胞(Tumor infiltrat

6、ing lymphocytes;TILs)，借助流式細(xì)胞技術(shù)分析不同部位γδT細(xì)胞表達(dá);利用RayBio HumanAntibody Array檢測趨化因子和細(xì)胞因子和γδT細(xì)胞浸潤相關(guān)性及表達(dá)差異。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)274個(gè)檢測指標(biāo)中，12個(gè)趨化因子蛋白癌內(nèi)相對(duì)癌旁上調(diào)，2個(gè)趨化因子癌內(nèi)相對(duì)癌旁下調(diào)，10個(gè)細(xì)胞因子癌內(nèi)相對(duì)癌旁上調(diào)，29個(gè)未分類因子癌內(nèi)相對(duì)癌旁上調(diào)，10個(gè)因子癌內(nèi)相對(duì)癌旁下調(diào)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CCL20與癌內(nèi)γδT細(xì)胞負(fù)

7、相關(guān)，Acrp30、MIP-3beta、ENA-78、FAS、b-NGF、MMP-8、MIF、MICB、IL-8、IL-6R、VCAM-1、TIMP-1、TIMP-2、PDGF-BB、GRO、GRO-alpha和HGF與之正相關(guān)。MSP-3-alpha與癌旁γδT細(xì)胞正相關(guān)。
　　綜上所述γδT細(xì)胞浸潤高低和肝癌內(nèi)、癌旁多種細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)異常有關(guān)。
　　第三部分 TSLP、CCL5和Foxp3陽性細(xì)胞與γδT細(xì)胞的相

8、關(guān)性研究
　　本研究目的是探索肝細(xì)胞癌患者TSLP、CCL5和Foxp3陽性細(xì)胞與γδT細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性。
　　通過免疫組織化學(xué)方法分析TSLP、CCL5和Foxp3與γδT細(xì)胞表達(dá)差異及相關(guān)性。
　　分析后發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞與Foxp3陽性細(xì)胞在癌內(nèi)無相關(guān)性，在癌旁卻呈正相關(guān)。TSLP與癌內(nèi)γδT細(xì)胞兩者間存在負(fù)相關(guān)性。TSLP和CCL5與Foxp3的表達(dá)無相關(guān)性。
　　TSLP和CCL5對(duì)γδT細(xì)胞異常分布有重要作

9、用。
　　第四部分 轉(zhuǎn)錄因子Eomes與肝癌預(yù)后的相關(guān)研究
　　轉(zhuǎn)錄因子Eomes是介導(dǎo)IFN-γ分泌的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)異常與淋巴細(xì)胞的激活和分化有重要相關(guān)性。本研究旨在通過分析Eomes與肝癌患者預(yù)后及淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性，探討轉(zhuǎn)錄因子在塑造肝細(xì)胞癌免疫微環(huán)境中的作用。
　　通過組織芯片免疫組織化學(xué)染色，分析Eomes在331例肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Eomes陽性細(xì)胞主要在分布在腫瘤間質(zhì)中。相

10、對(duì)于癌旁組織，癌組織中的γδT細(xì)胞浸潤程度明顯減少(平均值，28.60 vs.67.75，P＜0.0001)。陽性計(jì)數(shù)后利用“最小P值法”得到最佳臨界Eomes個(gè)數(shù)，癌旁為15，癌為10。可將病例分成癌旁高浸潤組(n=293)及低浸潤組(n=38);癌內(nèi)高浸潤組(n=168)及低浸潤組(n=163)。
　　單因素預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，癌旁Eomes陽性細(xì)胞低浸潤組總體生存率(OverallSurvival; OS)低于癌旁高浸潤組(OS，

11、P=0.009)，復(fù)發(fā)時(shí)間(Time to recurrence;TTR，P=0.292)無明顯差異。將有意義的臨床病理特征因素與癌旁Eomes陽性細(xì)胞納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型中進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示癌旁Eomes是肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)(P=0.028)。另外我們發(fā)現(xiàn)癌旁Eomes陽性細(xì)胞亦可作為BCLC患者OS的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)(P=0.006)。同時(shí)，我們對(duì)癌內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行單因素預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)Eomes陽性細(xì)胞低浸潤組OS低于高浸

12、潤組(OS，P=0.018;TTR，P=0.338)。將有意義的臨床病理特征因素納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型中進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示癌內(nèi)Eomes陽性細(xì)胞不是肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)(P=0.374)。另外我們發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)Eomes陽性細(xì)胞亦非BCLC患者OS的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，分析結(jié)果為(P=0.328)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，不同部位轉(zhuǎn)錄因子Eomes表達(dá)比例有明顯差別，γδT細(xì)胞和CD3+CD56-亞群表達(dá)比例癌內(nèi)相對(duì)于癌旁有明顯降低。